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SaraFluor™ Structural Imaging Series

SaraFluor™ 650B 標識抗体

[超解像イメージング用２次抗体]

650-750 nm：深赤色

蛍光顕微鏡によるイメージングの分解能は、光の波長の半分程度 (200－400 nm) が理論的な限界とされています。この制約を超える「超解像蛍光顕微鏡法」(superresolution fluorescence microscopy) と呼ばれるイメージング手法の１つとして、１分子局在化法 (single molecule localization microscopy, SMLM) が広く使われています。この SMLM 専用に開発されたSaraFluor B シリーズは生理的条件下で自発的な明滅を行う蛍光色素です。 STORM や PALM といった SMLM 用の顕微鏡システムを用い、蛍光色素を明滅させるためのレーザー照射や還元剤添加を行うことなく簡単に超解像画像を得ることができます。

本製品は免疫蛍光染色用の２次抗体です。
*SaraFluor はアイヌ語で「見えるようになる」「明るく開けた葦原」などの意味の sara という言葉に由来する造語です。自発的明滅を行う SaraFluor 色素には blinking の頭文字の B を付しています。
**各製品はそれぞれ HMSiR 標識 Goat IgG (whole) anti-mouse/rat/rabbit IgG H&L として販売してきたものと同一です。

 

価格

型番 製品名 容量 希望小売価格（税抜価格）
A202-01 SaraFluor™ 650B goat anti-mouse IgG 100 μg ￥ 59,800
A203-01 SaraFluor™ 650B goat anti-rat IgG 100 μg ￥ 59,800
A204-01 SaraFluor™ 650B goat anti-rabbit IgG 100 μg ￥ 59,800

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  • プロトコル

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  • 製品情報

    SaraFluor™ 650B 標識抗体
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    SaraFluor 650B 標識抗体の物性

    名称 Absmax (nm) FLmax (nm) ε* Φ
    SaraFluor 650B (HMSiR) 654 669 120,000 0.39

    *標識抗体のモル吸光係数。色素単体のモル吸光係数とは異なります。

     

    SaraFluor 650B 標識抗体の特性

    PBS (pH 7.4) 中でのSaraFluor B の自発的明滅。647 nm (SaraFluor 650B, HMSiR) または 488 nm (SaraFluor 488B, HEtetTFER)のレーザーによる全反射照明で励起した蛍光画像から、１分子相当の領域の輝度変化を計測したもの。（データ取得にあたり、北大ニコンイメージングセンターの設備を使用させていただきました）

     

    SaraFluor 650B 蛍光スペクトル

     

  • SaraFluor 650B 標識抗体 イメージング例

    SaraFluor™ 650B 標識抗体
    SaraFluor 650B 標識抗体 イメージング例

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    SaraFluor 650B 標識抗体 イメージング例

    HeLa 細胞仮足の拡大像。細胞を固定し、抗αチューブリン抗体 (DM1A, 1/4000 希釈) および SaraFluor 650B (HMSiR) 標識２次抗体 (A202-01, 30 μg/mL) で染色した。ニコン超解像顕微鏡システム (N-STORM) で647 nm レーザー励起し、NIKON Apo TIRF 100x (NA1.49) を用いて撮影した25,000 枚の画像の平均像 (Conventional, 通常の蛍光画像に相当する) と 1,000 枚および 25,000 枚の画像を ImageJ/ThunderSTORM で解析して得た超解像画像 (single molecule localization microscopy, SMLM) 。

     

  • SaraFluor B シリーズを用いた 3D-STORM による微小管の3次元イメージング

    SaraFluor™ 650B 標識抗体
    SaraFluor B シリーズを用いた 3D-STORM による微小管の3次元イメージング

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    3D-STORM による微小管の3次元イメージング

    SaraFluor B は生理的な溶液条件下で自発的に明滅する蛍光プローブです。これまでの dSTORM 観察の際に必要とされてきたチオールや脱酸素剤の添加の必要がなく、弱い励起光照射での観測が可能です。SaraFluor B で標識された試料を、ニコン超解像顕微鏡 N-STORM に搭載されているシリンドリカルレンズを用いて撮影・解析することにより、対物レンズの焦点を上下させることなく、３次元蛍光画像を得ることができます。

     

    SaraFluor B標識 Goat anti-mouse IgG (whole)により染色された 固定HeLa細胞内の微小管構造

    シリンドリカルレンズを通した蛍光像を撮影・解析することにより、光軸（Z軸）方向の位置を約 50 nm の精度で抽出。平面の位置情報と組み合わせることで、3D 蛍光画像を再構築した。東京大学医科学研究所　顕微鏡コアラボラトリーにおいて撮影。

    プロトコル

    1. ガラスボトムディッシュ上に培養したHeLa細胞を 3% パラホルムアルデヒドで、37℃で 20分間固定。
    2. PBS で洗浄
    3. 冷メタノールで－20℃、5分間浸透処理
    4. 5％ BSA 含有 PBS 中で 30 分間インキュベートし、ブロッキング。その後、PBS で 3 回（各 5 分以上）洗浄。
    5. 1次抗体で染色。マウス由来抗チューブリン抗体（Purified anti-Tubulin-α Antibody (625901), BioLegend）を PBSにて 10 μg/mL に希釈し、ガラスボトムディッシュ上の固定細胞に滴下し、室温で約 2 時間反応させました。その後、PBS で 3 回（各 5 分以上）洗浄しました。
    6. SaraFluor 650B goat anti-mouse IgG を PBSにて10 μg/mL に希釈し、ガラスボトムディッシュ上の固定細胞に滴下し、室温、暗所にて約 2 時間反応させました。その後、PBS で 3 回（各 5 分以上）洗浄しました。
    7. NIKON N-STORM 顕微鏡で、観察しました。励起光源は 647  nm レーザーを 100 W/cm2 で使用。カメラ前のシリンドリカルレンズを挿入し、顕微鏡のマニュアルに従って画像を取得し、3D-STORM 解析を行いました。

  • フレーム数および解析ソフトウェアによる SaraFluor B シリーズの超解像イメージの差

    SaraFluor™ 650B 標識抗体
    フレーム数および解析ソフトウェアによる SaraFluor B シリーズの超解像イメージの差

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    フレーム数および解析ソフトウェアによる超解像イメージの差

    SaraFluor B シリーズは生理的 pH の溶液中で自発的な点滅を示す蛍光色素です。PALM/STORM 用の顕微鏡システムを使わずとも、１分子蛍光が観察できる顕微鏡を用いて多数の画像を取得すれば、ImageJ プラグイン等のソフトウェアで解析することで超解像イメージを簡単に得ることができます。

    ImageJ プラグインとして ThunderSTORM が広く使われていますが、NanoJ SRRF という異なる原理に基づく超解像イメージング用プラグインでも、TRM モードで SaraFluor B シリーズの点滅する蛍光色素像から超解像イメージを作成可能です。ここでは異なる画像枚数および異なるソフトウェアによる画像解析結果を定性的に比較しました。

    固定した HeLa 細胞を αチューブリン抗体 (DM1A, 1/4000) （１次抗体）および SaraFluor™ 650B goat anti-mouse IgG (A202-01, 30 μg/mL) （２次抗体）で染色し、NIKON N-STORM システムを用いて 647 nm レーザーによる全反射照明を 100x Apo TIRF NA 1.49 でイメージングしました。露光時間は30 msec/frame。画像は各ソフトウェアで解析を行いました。

    このとき、ThunderSTORM では 1,000 枚程度では可視化されない微小管もある一方、10,000 枚程度の画像があると充分に可視化されました。 NanoJ SRRF (TRM) は画像枚数が少ないときでも情報がより多い様子が見られました。また ThunderSTORM は高いコントラストが得られた一方、NanoJ SRRF では画像枚数が多くてもコントラストや解像度が高くならない傾向が観察されました。

     

    参考文献

    M. Ovesný, P. Křížek, J. Borkovec, Z. Švindrych, G. M. Hagen. (2014) Bioinformatics 30:2389-2390 DOI: 10.1093/bioinformatics/btu202 (ThunderSTORM)

    Nils Gustafsson, Siân Culley, George Ashdown, Dylan M. Owen, Pedro Matos Pereira, & Ricardo Henriques (2016) Nature Communications 7: 12471  DOI: 10.1038/ncomms12471 (NanoJ SRRF)

     

    謝辞

    撮影および画像解析について、北大ニコンイメージングセンターの小林健太郎様および堤元佐先生にご教示をいただきました。感謝いたします。

     

参考文献

S. Uno, M. Kamiya, A. Morozumi, Y. Urano (2018) Chem. Commun. 54:102-105 DOI: 10.1039/c7cc07783a (SF488B, SF650B)

F-C. Chien, C-Y, Linb, G. Abrigo (2018) Phys. Chem. Chem. Phys. 20:27245-27255 DOI:10.1039/C8CP02942C (SF650B)

M. Ovesný, P. Křížek, J. Borkovec, Z. Švindrych, G. M. Hagen. (2014) Bioinformatics 30:2389-2390 DOI: 10.1093/bioinformatics/btu202 (ThunderSTORM)

S. Uno, M. Kamiya, T. Yoshihara, K. Sugawara, K. Okabe, M. C. Tarhan, H. Fujita, T. Funatsu, Y. Okada, S. Tobita, Y. Urano (2014) Nat. Chem. 6:681-689 DOI: 10.1038/NCHEM.2002 (SF650B)

※SaraFluor 650B は論文中では HMSiR という化合物名で表記されていることがあります。

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