MetalloFluor™ Series
[遊離鉄 (II) イオン検出用蛍光プローブ]
650-750 nm：深赤色
FerroFarRed は SiRhoNox-1, ER-SiRhoNox としても知られる、遊離鉄 (II) イオン (Fe2+ )を特異的に検出する深赤色蛍光プローブです。 鉄 (III) イオン (Fe3+) や鉄以外の2価の金属イオンでは蛍光強度は増加しません。FerroFarRed は高い細胞膜透過性があり、反応後は細胞内にとどまるため、ライブセルイメージングに使用できます。FerroFarRed は主に ER に局在します。さらに、赤色レーザーが搭載されているフローサイトメーターでも使用できます。
また、本試薬にキレート作用はございません。
FerroFarRed は Merck KGaA (Darmstadt, Germany) からも全世界にて
SCT 037 BioTracker™ Far-red Labile Fe2⁺ Dye の名前で販売されています。
FerroFarRed™
製品情報
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| 名称 | 検出対象 | 膜透過性 | 蛍光化 | Absmax (nm) | FLmax (nm) |
| FerroFarRed | 遊離鉄 (Fe2+） | あり | 不可逆 | 646 | 662 |
遊離した鉄 (II) イオン (Fe2+) を特異的に検出する蛍光プローブです。鉄 (III) イオン (Fe3+) や鉄以外の2価の金属イオンでは蛍光強度は増加しません。
FerroFarRed は青色、無蛍光の物質ですが、Fe2+と反応すると還元され、深赤色の蛍光物質へ非可逆的に変化します。
FerroFarRed の吸収および 蛍光スペクトル
Fe2+ との反応により、662 nm を最大とする蛍光強度が 25 倍程度増大します。
一般的な使用濃度の20倍 (100 μM) でも細胞毒性が見られません。
CCK-8 assay で測定した FerroFarRed の濃度ごとの HeLa 細胞の代謝活性
各濃度の FerroFarRed を培地（コソルベントとして0.1 % Dimethyl sulfoxide (DMSO) を含む）に添加しました。 3 時間反応させてから洗浄し、その24 時間後の代謝活性を CCK-8 assay により測定しました (n = 3; ±S. D.)。100 μM でも細胞の代謝活性に影響するような毒性は観察されませんでした。
FerroFarRed™
FerroFarRed の反応特性
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Fe2+ 存在下でのみ、FerroFarRed の顕著な蛍光増大が起こります。
さまざまな金属イオンに対する FerroFarRed の反応性。Fe2+ と反応したときの蛍光強度を 1.0 としたときの相対蛍光強度。
測定条件
5 μM FerroFarRed を溶解した HEPES buffer (0.05 M, pH 7.4, コソルベントとして 0.1 % DMSO を含む) に、各金属イオン (Na+, K+, Ca2+, Mg2+ は1 mM, その他は 20 μM) を添加。37 oC で 60 分反応後に蛍光強度を測定。
励起波長 630 nm, 測定波長 665 nm の蛍光強度をマイクロプレートリーダー (TECAN infinite M200Pro) にて計測。
5 μM FerroFarRed に 100 µM Fe(SO4)2(NH4)2 を添加後の、蛍光強度の経時変化
5 μM FerroFarRed を溶解した HEPES buffer (0.05 M, pH 7.4, コソルベントとして 0.1 % DMSOを含む) に 100 µM Fe(SO4)2(NH4)2を添加。
得られた溶液の蛍光強度の経時変化をマイクロプレートリーダー (TECAN infinite M200Pro) で 30 秒ごとに測定。励起波長 630 nm, 測定波長 665 nm, n = 3 ± S.D.
反応は迅速で、この条件ではおよそ 10 分で蛍光がピークとなりました。
FerroFarRed™
FerroFarRed を用いたイメージング、測定例
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コントロール（-Fe2+）と比較して、培地中に鉄を添加し Fe2+ を取り込ませた細胞（+Fe2+）では蛍光の増大が観察されました。一方鉄を添加した上で鉄のキレート剤を加えると蛍光はほとんど観察されなくなりました。（+Fe2+ +Bpy）
Fe2+ 添加なし（左図）、Fe2+ 添加（中央図）、Fe2+ およびキレート剤を添加（右図）における HeLa 細胞の FerroFarRed によるライブセルイメージング。HeLa 細胞を 5 μM FerroFarRed を含む無血清培地で1 時間培養し、蛍光像を取得しました。Fe2+ の取り込みは、あらかじめ 100 μMの Fe(SO4)2(NH4)2 を含む無血清培地中で HeLa 細胞を 30 分間培養し、細胞を HBSS で洗浄して細胞外の Fe2+ を取り除くことで実施しました。また、FerroFarRed と同時に鉄のキレート剤として 1 mM Bpy (2,2′-Bipyridyl) を加えることで、その効果を観察しました。画像は蛍光像と DIC の重ね合わせで、マゼンダの疑似カラーは、ex. 590-650 nm, em. 660-740 nm で撮影した FerroFarRed の蛍光像、グレーの疑似カラーは DIC 画像を示しています。
HeLa 細胞に FerroFarRed（左：マゼンタ）を反応させるとともに ER Tracker（緑）との共局在を示しました。FerroFarRed は、主にERに局在すると考えられます。
赤色レーザーが搭載されているフローサイトメーターでは、FerroFarRed を用いて Fe2+ の変化を測定することができます。フローサイトメーターでもライブセルイメージングと同様の結果を得ることができます。
FerroFarRed と反応させた HepG2 細胞の解析結果。それぞれの分布は Fe2+ 添加なし（黒破線）、Fe2+ 添加（赤実線）、Fe2+ およびキレート剤添加（青点線）を示します。 HepG2 細胞を 5 μM FerroFarRed を含む無血清培地で 1 時間培養したのちフローサイトメトリーを実施しました。Fe2+ の取り込みは、あらかじめ 100 μMの Fe(SO4)2(NH4)2 を含む無血清培地中で HepG2 細胞を 30 分間培養し、細胞を HBSS で洗浄して細胞外の Fe2+ を取り除くことで実施しました。また、FerroFarRedと同時に鉄のキレート剤として 1 mM Bpy (2,2′-Bipyridyl) を加えることでその効果を観察しました。 640 nmレーザーを使用して励起し、蛍光フィルターは APC (Allophycocyanin) 用を使用して測定しました。
プローブは ER や Golgi に局在することが知られていますが、このプローブが検出する Fe2+ は細胞質の Fe2+ も反映しているのではないかと考えられています。ただし、これをきちんと検証した報告はありません
パラフィン切片での使用は基本的にはできないとお考えください。
生細胞の状態でプローブと反応させた後に、3% paraformaldehyde (PFA) ４℃ 10分固定した場合には検出できた例があります。室温での固定や20分以上の固定では蛍光が著しく減弱することが確認されております。
また、検証はしていませんが、固定後にこれらの蛍光プローブを添加して鉄を検出することは難しいと考えられます。
検出感度が最も高いのは FerroOrange です。赤色レーザーを使用したフローサイトメトリーには FerroFarRed が最適です。
FeRhoNox-1 は論文実績が豊富にあるため、既存の報告を確実に再現させたい場合に最適です。
| 型番 | 製品名 | Exmax (nm) | Emmax (nm) | 蛍光顕微鏡 | フローサイトメトリー (青色レーザー) |
フローサイトメトリー (赤色レーザー) |
プレートリーダー |
| AR2901-U5 | FeRhoNox-1 | 540 | 575 | 〇 | △ | － | 〇 |
| GC903 | FerroFarRed | 646 | 662 | 〇 | － | 〇 | 〇 |
| GC904 | FerroOrange | 542 | 572 | 〇 | △ | － | 〇 |
FeRhoNox-1, FerroOrange をレーザー励起で検出するためには、532 nm 等のグリーンレーザーの使用を推奨します。
蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください
H.Jiang , R. K. Muir, R. L. Gonciarz, A. B. Olshen, I. Yeh, B. C. Hann, N. Zhao, Y. H. Wang , S. C. Behr, J. E. Korkola, M. J. Evans, E. A. Collisson, A. R. Renslo (2022)
J. Exp. Med. 219: e20210739. DOI: 10.1084/jem.20210739
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J. Clin. Biochem. Nutr. 65 : 8-15 DOI : 10.3164/jcbn.18-91
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T. Hirayama, H. Tsuboi, M. Niwa, A. Miki, S. Kadota, Y. Ikeshita, K. Okuda, H. Nagasawa (2017)
Chem. Sci. 8: 4858-4866 DOI: 10.1039/c6sc05457a
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