AcidiFluor™ Series HaloFluor™ Series
[ハロタグリガンド化酸性 pH 応答性プローブ]
570-590 nm：橙色
酸性 pH インジケーターである AcidiFluor ORANGE に HaloTag® と共有結合する HaloTag ligand を付加したものです。中性 pH ではほとんど蛍光を示さず、酸性になると強い蛍光を示します。
膜透過性が低く、膜表面の HaloTag 融合タンパク質を標識することで、そのタンパク質のエンドサイトーシス・エキソサイトーシスを可視化することができます。
※HaloTag® は Promega Cooperation の登録商標です。五稜化薬は Promega Cooporation とのライセンス契約に基づき HaloTag ligand 製品を製造販売しています。
HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligandは Merck KGaA (Darmstadt, Germany) からも全世界にて
SCT212-30nmol HaloTag® AcidiFluor™ORANGE Ligand
SCT212-60nmol HaloTag® AcidiFluor™ORANGE Ligand
の名前で販売されています。
| 型番 | 製品名 | 容量 | 希望小売価格（税抜価格） |
|---|---|---|---|
| GC310-01 | HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand | 30 nmol | ￥ 78,000 |
| GC310-02 | HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand | 60 nmol | ￥ 150,000 |
HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand
製品情報
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| 名前 |
検出対象 | 反応 | pKa |
Absmax (nm) | FLmax (nm) | ε | Φ* |
| HaloTag AcidiFluor ORANGE ligand | pH | 可逆的 | 5.0 | 520 | 565 | 60,000 | 0.7 |
*最大量子収率を示しています。実際には pH によって変化します。
左）pH 5.0 および 7.5 における蛍光スペクトル。
右）pH ごとの蛍光強度変化
HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand
HaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand によるイメージング例
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HaloTag を付加した EGFR を発現させた細胞に HaloTag AcidiFluor ORANGE Ligand を投与し、細胞膜表面に露出した EGFR に HaloTag を介してHaloTag AcidiFluor ORANGE Ligand を結合させると、細胞表面では細胞外液の中性 pH のため蛍光が観察されないが、エンドサイトーシスによって小胞を形成し、小胞が酸性化すると蛍光が観察されるようになる。一方、エキソサイトーシスによって細胞外の pH と一致することで、即座に蛍光が消光する。
RBL-2H3 細胞にScreenFect™ A (和光純薬) を用いて HaloTag-EGFP 発現ベクター を導入して６時間培養後、 anti-DNP IgG を 1 μg/mL になるように培地に添加して 16 時間培養した。その後、培地交換して洗浄し、2 μM のHaloTag® AcidiFluor™ ORANGE Ligand を含んだ培地中で 30 分間培養後、HBSS で洗浄して観察した。観察直前に 50 μg/mL DNP-BSA で刺激し、エンドサイトーシス、エキソサイトーシスを誘導した。観察には、NIKON Ti-E, PlanFluor 40/1.3 および Hamamatsu ORCA-R2 を用いた。マゼンタの疑似カラーが AcidiFluor™ ORANGE の蛍光を示す。（撮影にあたっては北海道大学ニコンイメージングセンターの設備を利用させていただきました。）
基本的には固定細胞では使用できません。リソソームやエンドソームの酸性 pH は生きている細胞の活性によって酸性 pH が保たれており、固定により死んだ細胞ではその酸性が維持されなくなるためです。
ただし、リソソームに局在する AcidiFluor ORANGE、抗体などを標識した AcidiFluor-NHS や HaloTag に結合した HaloTag AcidiFluor ORANGE ligand の局在を知る目的で、固定後速やかに酸性 pH バッファーに置換して蛍光を確認することは可能と考えられます。
蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください
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