OxiORANGE™

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¥49,800

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型番 製品名 容量 希望小売価格(円)
GC3004-01 OxiORANGE™ 100 nmol ×5 ¥ 49,800

OxiORANGE™ はヒドロキシラジカル (OH) および次亜塩素酸(HClO) と反応してオレンジ色の蛍光を発する蛍光プローブです。赤に近い蛍光波長を持つため、GFP や Hoechist 33342 などの蛍光と区別することが可能です。
正電荷を持つためミトコンドリアに局在しやすい性質があります。光褪色にも強く、生細胞のイメージングに最適です。

特徴

  • 活性酸素種 (OH, O2-・,HClO, H2O2NO, ONOO など) の中でも、hROS と呼ばれる反応性の高いヒドロキシラジカル (OH) および次亜塩素酸 (HClO) を検出できます。スーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素、パーオキシナイトライトでは蛍光強度の増加が見られません。
  • 比較的強い蛍光を示し、光褪色にも強いため、細胞内の hROS 産生のタイムラプスイメージングに適します。
  • オレンジ色の蛍光を示すため、緑や青色、長波長赤色などの蛍光色素とのマルチカラーイメージングが可能です。
  • 細胞内ではミトコンドリアに蓄積し、高い細胞内滞留性を示します。
  • ROS との反応後に固定しても蛍光が保たれます。(3-4% 以下のパラホルムアルデヒド)

測定原理

OxiORANGE™ は中性水溶液中でほとんど蛍光を発しませんが、OH または HClO と反応すると、強蛍光化合物に変化し (励起最大波長 553 nm、蛍光最大波長 577 nm) 、蛍光強度の増大が観測されます。 細胞膜透過性が高く、細胞内では膜電位によってミトコンドリアに蓄積します。

OxiORANGE™ の性質

図1. 吸光および蛍光スペクトル(左)と活性酸素種に対する反応選択性(右)

OHとの反応前に比べ、反応後はおよそ30倍の蛍光が検出されます。

スペクトル(左)測定条件

  • OxiORANGE™ (最終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、NaOCl (終濃度5 μM) を加え、スペクトルを測定した。
  • 励起波長553 nm、slit width 2.5mm, photon multiplier voltage 700V.

反応選択性測定条件(右)

  • OxiORANGE™ (終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、以下の活性酸素種生成系を添加 (最終濃度)。
  • 励起波長553 nm、測定波長577 nm, slit width 2.5mm, photon multiplier voltage 700V.

各活性酸素種生成条件

OH: 過塩素酸鉄 (II) 300 μM, H2O2 1 mM, RT, 5 min
ONOO: ONOO 50 μM, RT, 5 min
HClO: NaOCl 50 μM, RT, 5 min
NO: NOC18 5 μM, 37℃, 30 min
O2-・: KO2 100 μM, 37℃, 30 min
H2O2: H2O2 100 μM, 37℃, 30 min

特徴1. 明るく観察しやすい蛍光

図2. ミトコンドリア局在性の酸化ストレス検出プローブ比較。

OxiORANGE™(上段), 他社製品A(中段), 他社製品B(下段)各 1 μM を添加した培地中でRBL-2H3 細胞を15分インキュベートしたのち洗浄し、0.5 μM H2O2 を加えて ROS 産生を誘導した直後(左)と20分後(右)。照明光強度と露出条件を揃えて撮影。それぞれ異なる酸化ストレス物質を検出する試薬ではあるが、一般的な酸化ストレス検出用途としてはOxiORANGE™ の蛍光は明るくて観察しやすいことがわかる。
また、製品B は時間経過とともに核内へ移行するのが観察されたが、OxiORANGE™ では局在の大きな変化は観察されなかった。
使用顕微鏡: NIKON Eclipse Ti, (PlanFluor 40×0.75), HAMAMATSU ORCA-R2

図3. 活性酸素種検出試薬の比較。

特徴2. 固定後にも観察可能

OxiORANGE™ はROS との反応により、蛍光物質に非可逆的に変化します。そのため固定後も蛍光が観察できます。

図4. 固定による蛍光の変化。

HeLa細胞を 1 μM の OxiORANGE™ と0.2 μg/mL Hoechist 33342 を含む培地で 30分間培養したのち、 HBSS で2回洗浄し、500 μM の H2O2 で刺激し、30分間に渡りROS 発生を観察した(左)。その後 3% PFA を含む PBS で 4℃ 20 分間固定してから、再度、同条件で撮影した(右)。
赤: OxiORANGE™, 青: Hoechist33342, グレー: DIC の重ね合わせ。
※ 使用顕微鏡: NIKON ECLIPSE Ti, (PlanFluor 40×0.75) ), Hamamatsu ORCA-R2

OxiORANGE™ の細胞内での局在は、固定により変化します。また、固定により蛍光が若干減弱することがあるため、ご使用前に条件検討を行ってください。

OxiORANGE™ の細胞内局在

OxiORANGE™ はミトコンドリアに局在しやすい性質がありますが、試薬濃度が高い場合や、他のミトコンドリア局在性試薬などと共存させること、その他の理由でミトコンドリア以外にも分布する場合があります。

  • HeLa細胞をOxiORANGE™ (0.5 μM), MitoTrackerGREEN (0.25 μM), Hoechst33342と共染(0.2 μg/mL, 30 min incubation)
  • 過酸化水素で刺激 (100 μM 30 min)
  • 蛍光顕微鏡で観察

参考文献

Y. Koide, Y. Urano, S. Kenmoku, H. Kojima, T. Nagano (2007)
J. Am. Chem. Soc. 129: 10324-10325 DOI:10.1021/ja073220m

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