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ROSFluor™ Series

Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) /Aminophenyl Fluorescein (APF)

[酸化ストレス (ROS) 検出用蛍光プローブ]

495-540 nm：緑色

HPF (hydroxyphenyl fluorescein) および APF (aminophenyl fluorescein) は活性酸素種 (reactive oxygen species, ROS) の中でも強い活性を持つ hROS (highly reactive oxigen species) を検出できる試薬です。ヒドロキシラジカル (・OH) およびパーオキシナイトライト (ONOO－) のほか、APF は次亜塩素酸 (HClO) とも反応します。その他の活性酸素種等 (O-・2 , H2O2 , 1O2 , NO) とはほとんど反応しません。生細胞の培地中に添加することで、細胞内で発生する hROS を緑の蛍光として検出できます。励起光による自動酸化 (autooxidation) がほとんどないため、取り扱いが容易で信頼性の高いデータを得ることができます。

ラインナップには 1 mg の乾燥固体またはあらかじめ DMF に溶解した溶液があります。

 

 

価格

型番 製品名 容量 希望小売価格（税抜価格）
SK3001-01 Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) 1 mg （DMF 溶液） ￥ 35,000
SK3001-02 Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) 1 mg （固体） ￥ 35,000
SK3002-01 Aminophenyl Fluorescein (APF) 1 mg （DMF 溶液） ￥ 35,000
SK3002-02 Aminophenyl Fluorescein (APF) 1 mg （固体） ￥ 35,000

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    Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) /Aminophenyl Fluorescein (APF)
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    HPF, APF の反応原理

    HPF, APF は中性水溶液中でほとんど蛍光を示しませんが、強い活性を持つ活性酸素種と反応して強蛍光性化合物であるフルオレセイン（励起波長 490 nm，蛍光波長 515 nm）が生成され、蛍光強度の増大が観測されます。

     

    HPF，APF および DCFH と活性酸素種との反応性

    活性酸素種検出試薬である dichlorofluorescein (DCFH) と HPF, APF の反応性比較結果

    蛍光プローブ試薬（最終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMFを添加）のリン酸バッファー（0.1 M, pH 7.4）溶液に以下の活性酸素種生成系を加え、HPF, APF, DCFH の蛍光強度をそれぞれ 490, 490, 500 nm で励起し、測定波長 515, 515, 520 nm でそれぞれ測定した。

    1. 過塩素酸鉄（Ⅱ）100μM と H2O2 1 mM を加えた。
    2. ONOO－ を 3 μM（最終濃度）加えた。
    3. NaOCl を 3 μM（最終濃度）加えた。
    4. 3(- 1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl) propionic acid を 100 μM 加えた。
    5. KO2 を 100 μM 加えた。
    6. H2O2 を 100 μM 加えた。
    7. 1-Hydroxy-2-oxo-3-(3-aminopropyl)-3-methyl-1-triazene を 100 μM 加えた。
    8. 2,2′-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride を 100 μM 加えた。
    9. 蛍光プローブ試薬溶液に蛍光灯光を 2.5 時間照射した。（自己酸化条件）

    使用方法

    本品は 1 mg が N,N -dimethylformamide (DMF) 0.47 mL に溶解された、5 mmol/L の溶液です。使用時にリン酸バッファー（0.1 mol/L，pH 7.4）等で 500～5000 倍（10～1 μmol/L）程度に希釈してご使用ください。

    試料に調製液を添加し、一定時間反応させた後、励起波長 490 nm、測定波長 515 nm で蛍光を測定します。

     

  • APF, HPF の光励起による自己酸化の検討

    Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) /Aminophenyl Fluorescein (APF)
    APF, HPF の光励起による自己酸化の検討

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    APF, HPF の光励起による自己酸化 (autooxidation) について

    蛍光プローブ試薬添加

    1. HeLa 細胞を 4×105 cell/mL で 3.5 cm シャーレに播種し、一晩接着させました。
    2. HeLa 細胞に APF, HPF または DCFH-DA (10 μM) を加えて、暗所で 37 ℃、30 分間インキュベートしました。

     

    蛍光測定

    1. 共焦点蛍光顕微鏡でレーザーを照射させずに撮影しました (Before)。
    2. 次に、細胞に 488 nm のレーザーを 120 秒間照射し、再度測定しました (After)。

     

    励起光の連続照射による自己酸化の検出

    Hela 細胞を各試薬で染色し (Before)、120 秒間励起後 (After)、顕微鏡で観察しました。DCFH-DA（他社製品）は、自己酸化による蛍光が発生し、シグナル検出が困難です（上段）。一方、APF, HPF では自己酸化による蛍光強度の増大がほとんど見られません（中段、下段）。緑の疑似カラーは蛍光像、グレーの疑似カラーは DIC 画像を示しています。

  • FerroOrange および ROSFluor シリーズを用いたフェロトーシス (ferroptosis) 時間経過の生細胞イメージング

    Hydroxyphenyl Fluorescein (HPF) /Aminophenyl Fluorescein (APF)
    FerroOrange および ROSFluor シリーズを用いたフェロトーシス (ferroptosis) 時間経過の生細胞イメージング

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    FerroOrange および ROSFluor シリーズを用いたフェロトーシス (ferroptosis) 時間経過の生細胞イメージング

    フェロトーシスは細胞内の遊離鉄 (Fe2+) 依存的な細胞死で、アポトーシスやネクローシス等とは異なるメカニズムであることが知られています。過剰な Fe2+ により発生した活性酸素種 (ROS) により脂質過酸化などが引き起こされ、細胞死が誘導されます。いくつかの神経変性疾患においてフェロトーシスが引き起こされること、がん細胞はフェロトーシス抵抗性であることも明らかになってきています。
    　ここでは、フェロトーシスを誘導する細胞内の過剰な Fe2+ を FerroOrange で検出するとともに、ROSFluor シリーズの APF, OxiORANGE および HYDROP による細胞内活性酸素種の検出を試みました。

    フェロトーシス過程における鉄イオンおよび活性酸素種発生の可視化

    HT-1080 細胞への erastin 投与によってフェロトーシスを誘導し、細胞死に至るまでの途中となる 3, ６, 9 時間後の各時点における細胞内の Fe2+ および ROS 発生を蛍光イメージングしました。30 µM erastin 投与後、各観察時点の 30 分前に FerroOrange (1 μM),  APF (5 μM), HYDROP (1 μM), および OxiORANGE (1 μM) を添加し細胞と反応させました。遊離 Fe2+ を検出する FerroOrange は erastin 刺激後 3 時間で一番蛍光強度が高くなりましたが、ヒドロキシラジカル (·OH)、次亜塩素酸 (HClO)、およびパーオキシナイトライト (ONOO–) を検出するAPF、ヒドロキシラジカル (·OH) と次亜塩素酸 (HClO) を検出する OxiORANGE、および H2O2 を特異的に検出する HYDROP は、刺激後 6 時間で蛍光強度が最大となり、その後減少する蛍光が観察されました。これらのことから、フェロトーシスの過程においては細胞内鉄イオンの増加に続いて活性酸素種が増加することが確認できました。

    フェロトーシスを誘導した HT-1080 細胞における FerroOrange および APF の蛍光の変化

    Erastin を添加した HT-1080 細胞の FerroOrange および APF の蛍光を、各波長域の蛍光強度（上段、中段）および疑似カラーで重ね合わせた。マゼンタは FerroOrange の蛍光、緑は APF の蛍光を示す。スケールバーは、100 µm。

    フェロトーシスを誘導した HT-1080 細胞における OxiOrange および HYDROP の蛍光の変化

    Erastin を添加した HT-1080 細胞の OxiOrange および HYDROP の蛍光を、各波長域の蛍光強度（上段、中段）および疑似カラーで重ね合わせた。マゼンタは OxiOrange の蛍光、緑は HYDROP の蛍光を示す。スケールバーは、100 µm。

     

    実験プロトコル

    1. 3.5 cm ガラスボトムディッシュ（培養容器）に 2 × 105 個の HT-1080 細胞を播種して培養し、細胞を接着させた。
    2. 培養上清に終濃度が 30 µM となるように erastin を加え、37℃, 5% CO2 条件下で 3, 6, 9 時間培養。
    3. Erastin 刺激後 2.5, 5.5, 8.5 時間の時点で、に培養上清に各プローブを添加し、37℃,  5% CO2 条件下で 30 分間培養。
    4. 上記細胞を HBSSで 2 回リンスし、蛍光顕微鏡で観察。

    ※細胞の培養条件等により最適な条件は異なる可能性があります。本実験でも、事前に予備試験により試薬濃度および観察までの時間を調整しました。
    ※細胞がディッシュからはがれやすい場合は、 poly-L-lysine コーティングしたディッシュを使用してください。

    実験のタイムスケジュール。3 時間ごとにずらして erastin を投与し、洗浄、蛍光プローブとの反応は、全てのサンプルで同時に行いました。不可逆的な反応をする蛍光プローブで反応の時間経過を観察するため、同条件の細胞を複数用意し、時間を変えて実験することで、擬似的に時間変化を観察しました。

     

よくあるご質問

  • Q APFとHPFの違いは？
    A

    APF は HPF より感度が高いほか、HPF はヒドロキシラジカルとパーオキシナイトライト (・OH, ONOO–) と反応しますが、APF はそれらに加えて次亜塩素酸イオン (OCl–) とも反応するといった違いがあります。

  • Q APFとHPFは細胞透過性ですか？
    A

    両方とも細胞膜を通過します。よって細胞内のイメージングにもご使用できます。

  • Q APF や HPF は in vivo で使用できますか？
    A

    HPF は、ラットの大脳皮質のイメージングに使用している報告がございます。詳しくは以下の文献をご参照ください。
    Y. Wang,  S. Yamamoto, A. Miyakawa, T. Sakurai, K. Ibaraki,  S. Terakawa (2010)
    Neurosurgery. 67: 112-118 DOI: 10.1227/01.NEU.0000370055.99998.6B

    その他、HPF は凍結切片や脳スライスでの使用も報告されております。

    一方、APF に関しては、HPF で使用可能な場合でも使用できないケースが多く見受けられます。

  • Q OxiORANGE, HYDROP, APF, HPF の溶媒に DMSO は使えますか？
    A

    DMSO はヒドロキシラジカルのクエンチャーになることが知られています。そのため、これらの試薬がヒドロキシラジカルまたはヒドロキシラジカルの影響で増加する ROS を検出しづらくなることが予想されるため、溶媒として DMF を推奨しています。

  • Q ROSFluor シリーズの使い分けを教えてください
    A

    以下の表をご参照ください。

    型番 製品名 Exmax (nm) Emmax (nm) ・OH ONOO— HClO H2O2 O2－・ 溶液中での
    ROS検出    		 培養細胞内でのROS検出
    GC3004-01 OxiORANGE 553 577 + － + － － + +
    GC3006-01 HySOx 553 574 － － + － － + +
    GC3007-01 HYDROP 492 518 － － － + － – +
    GC3008-01 HYDROP-EX※ 492 518 － － － + － + –
    SK3001-01 HPF 490 515 + + － － － + +
    SK3002-01 APF 490 515 + + + － － + +
    SK3003-01 NiSPY-3 490 515 － + － － － + +

    ※HYDROP-EXは細胞膜透過性が低く、細胞外や溶液中の H2O2 の測定に適しています。一方 HYDROP はジアセチル化された試薬で、細胞外の H2O2 検出はできません。

  • Q Q&A を見ても問題が解決しません
    A

    蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください

参考文献

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