NOFluor™ Series
[細胞内での一酸化窒素検出に（緑色蛍光）]
495-540 nm：緑色
Diaminofluorescein-FM diacetate (DAF-FM DA) は細胞内の一酸化窒素 (NO) を検出する蛍光プローブです。ジアセチル化された DAF-FM で、膜透過性があります。細胞内で分解されて膜透過しにくい DAF-FM を生成し、細胞内の NO と反応して蛍光を発します。DAF-2 に比べて pH 6 付近での蛍光特性が改善されており、pH 6 以上でお使いいただけます。
DAF-FM DA (Diaminofluorescein-FM diacetate)
製品情報
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DAF-FM DAが細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼにより加水分解され、細胞膜を透過しにくいDAF-FMになります。
DAF-FM のアミノ基が NO と反応し蛍光物質が生成されます。励起波長 495 nm 付近の青色光で励起すると波長 515 nm 付近の緑色蛍光を発します。
| 名称 | 検出対象 | 反応 | pH 範囲 | Absmax (nm) | FLmax (nm) | ε | Φ |
| DAF-FM | NO | 不可逆 | >5.5 | 495 | 515 | 73,000 | 0.81 |
DAF-FM DA 1 mg が DMSO 0.4 mL に溶解された溶液です。
C25H18F2N2O7
MW：496.42
細胞内での分解を直接測定するのは困難で、データはありません。脳組織のホモジネートを用いた予備的な検討では DAF-2 DA が10分以内に変換されました。
はい可能です。下記の文献ではフローサイトメトリーへの DAF 試薬の応用が報告されています。
Havenga, M. J. E. et al. Simultaneous Detection of NOS-3 Protein Expression and Nitric Oxide Production Using a Flow Cytometer. Anal. Biochem. 2001, 290, 283-291.
Navarro-Antolin, J. and Lamas, S. Nitrosative Stress by Cyclosporin A in the Endothelium: Studies with the NO-Sensitive Prove Diaminofluorescein-2/ diacetate using flow cytometry. Nephrol Dial Transplant, 2001, 16 [Suppl 1], 6-9.
Jozsef L, Zouki C, Petasis NA, Serhan CN, Filep JG. Lipoxin A4 and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 inhibit peroxynitrite formation, NF-kappa B and AP-1 activation, and IL-8 gene expression in human leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 13266-71.
DAF-2 を用いた pH 7 付近のバッファー中での NO 検出限界は 5 nM と報告されています。 DAF-FM では蛍光強度は DAF-2 の 1.5 倍ありますので、若干高感度となると思われます。また DAF-2 DA や DAF-FM DA を用いて細胞内で検出する場合、細胞内の物質に妨害され感度がこれらより低下する可能性があります。
10 μM 程度では明らかな細胞毒性は認められませんでした。万一、毒性が疑わしい場合は濃度を下げてください。
5 – 10 μM （500 – 1000 倍希釈）程度です。ご使用の試料・バッファーの種類により変わる場合もあります。ただし、強いシグナルを得るために試薬の濃度を上げることはフルオレセイン系化合物の性質上、逆効果のようです。
NOが速やかに酸素と反応して NO2－ や NO3－ に変化する途中の中間体と反応しています。この中間体は生理的な条件下ではNO生成がない限り生成しないため、DAF 類は NO を特異的に検出することになります。
細胞内で分解され、膜透過性の低い DAF-2, DAF-FM または DAR-4M になりますが、少しずつ細胞外に漏れていきます。NO と反応しトリアゾール体になった後も少しずつ細胞外に漏れていきます。
第１選択としては DAF-FM （細胞外での検出）または DAF-FM DA （細胞内での検出）をお勧めします。
DAF-2 および DAF-2 DA は実績が多いため、論文の再現実験などに使用したいといった目的の場合によく使用されます。一方、DAF-FM は pH 6-7 の範囲での特性が改善されていますので、多くの場合は DAF-FM の方をおすすめします。
更に酸性領域での検出が必要になる可能性がある場合、もしくは緑の自家蛍光が問題になる場合等には DAR-4M AM が使用されます。
| 型番 | 製品名 | Exmax (nm) | Emmax (nm) | 膜透過性 | 使用可能 pH |
| SK1001-01 | DAF-2 | 495 | 515 | – | >7 |
| SK1002-01 | DAF-2 DA | 495 | 515 | + | >7 |
| SK1003-01 | DAF-FM | 495 | 515 | – | >5.5 |
| SK1004-01 | DAF-FM DA | 495 | 515 | + | >5.5 |
| SK1005-01 | DAR-4M | 560 | 575 | – | 4-12 |
| SK1006-01 | DAR-4M AM | 560 | 575 | + | 4-12 |
生理的な条件では亜硝酸イオン （NO2－）や 硝酸イオン（NO3－） と反応することはありません。ただし NO2－ が高濃度（10 mM 以上）存在して長時間インキュベートした場合には若干蛍光が出ます。
豊富な論文例がありますので参考文献または文献リストを参照してください。培養細胞、血管内皮細胞、海馬などの脳・神経組織、末梢血単核球、骨髄幹細胞、ミミズ神経節、植物細胞等での使用実績があります。測定法としては蛍光顕微鏡による画像観察、画像上特定点の蛍光強度測定、マルチウエルプレートリーダーによる測定等があります。
フェノールレッドやビタミン類など蛍光性の物質が観察に影響する場合があります。また培地に添加される血清、BSAなどのタンパクにより NO 検出効率が低下する場合があります。
厳密な定量には濃度の分かっている NO ガスの溶液を用いる必要があります。しかし実際的には、若干の誤差はありますが NONOate （１分子から２分子の NO が生成）を用いるのがよいと思われます。
正確なデータはありませんが、例えばラット大動脈平滑筋細胞への DAF-2 DA ローディングは 1 時間 (Kojima, H. et al. Chem. Pharm. Bull, 1998, 46, 373-75)、ウシ大動脈由来の内皮細胞 primaly culture への DAR-4M AM ローディングには 30 分 (Kojima, H. et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1967-73) で行われています。既存の報告例を元にご自身の系でご検討ください。
多くのバクテリアでは細胞外に様々な酵素を分泌することが多く、DAF-FM DA のようなジアセチル化されたプローブは細胞に入る前に加水分解される恐れがあります。実際に例えば、DAF-FM DA は B. subtilis の細胞外のエステラーゼで分解されて細胞内に入らなかったという報告もあります。一般的にジアセチル化されたプローブは真核細胞の細胞内に導入するための方法として使用されており、バクテリアでは使用が難しいと考えられます。
蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください
Y. Takenaka, I. Inoue, T. Nakano, M. Ikeda, Y. Kakinuma (2022)
FEBS J. 289: 1650-1667 DOI: 10.1111/febs.16249
（この論文はOxiORANGE、HYDROPとDAF-FM DAを使用しています）
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K. Sako, C. V. Ha, A. Matsui, M. Tanaka, A. Sato, M. Seki (2021)
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M. Fukudome, E. Watanabe, K. Osuki, N. Uchi, T Uchiumi (2019)
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