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AcidiFluor™ Series

AcidiFluor™ ORANGE Labeling Kit

[オールインワンタイプの標識用キット]

[酸性 pH 応答性プローブ]

570-590 nm：橙色

AcidiFluor ORANGE-NHS (succinimidyl ester)  は、タンパク質等のアミノ基に結合する、縮合剤が不要なpHプローブAcidiFluor™ ORANGEです。抗体等のタンパク質だけでなく、末端アミノ化を施したオリゴヌクレオチドへの標識も可能です。

本キットは、AcidiFluor ORANGE-NHSの標識から精製までの一連の作業に必要な試薬、器具 5 回分がセットになっています。 AcidiFluor ORANGE-NHS  1 本には、100 μg の IgG 等タンパク質へのラベル化に最適な量が含まれています。

価格

型番 製品名 容量 希望小売価格（税抜価格）
GC304 AcidiFluor™ ORANGE Labeling Kit ５回分 ￥ 69,800

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    AcidiFluor ORANGE Labeling Kit 概要

    AcidiFluor ORANGE-NHS は下図のように、NHS を介してタンパク質のリジン残基等に含まれる１級アミンを標識できます。

    キット内容
    • AcidiFluor ORANGE-NHS× 5
    • Reaction Buffer  1.5 mL × 1
    • Washing Buffer 10 mL × 1
    • 限外ろ過スピンカラム× 5

     

    AcidiFluor ORANGE-NHS の物性

    名称 検出対象 反応 pKa
    		 Absmax (nm) FLmax (nm) ε Φ
    AcidiFluor ORANGE-NHS pH 可逆 5.3, 6.8 544 565 80,000 0.7

     

    S/N 比が高い

    pH 5 および 7.4 のリン酸緩衝液中 (0.1 M) で、各 pH プローブの NHS 体および BSA 標識体の蛍光強度を比較した。pH 5.0 における AcidiFluor ORANGE-NHS の蛍光強度は pH 7.4 と比較して、約 20 倍に増大した。一方、pHrodo™ Red-NHS  (Life Technology 社) は約 1.8 倍、CypHer™ 5E-NHS  (GE Healthcare) は約 7.5 倍であり、AcidiFluor ORANGE-NHS がより鋭敏に酸性 pH を捉えた。同様に BSA 標識体の測定結果から、標識後の pH 応答性は AcidiFluor ORANGE のみで高く維持されることが示された。

    AcidiFluor™ ORANGE-NHS : λex 532 nm / λem 568 nm
    pHrodo™ Red-NHS (Life Technology社) : λex 560nm / /λem 582 nm
    CypHer™ 5E-NHS (GE Healthcare社) : λex 644 nm / /λem 667 nm

     

    細胞内の箇所を選択し、経時的な蛍光強度をグラフ化した。AcidiFluor™ ORANGE-BSAは、細胞に取り込まれると経時的に蛍光強度が上昇したが、pHrodo-BSA、CypHer5E-BSAは、蛍光強度変化は観察されなかった。

     

    AcidiFluor™ ORANGE-NHS – BSA標識体のHeLa細胞によるエンドサイトーシス観察

  • AcidiFluor ORANGE-NHS および AcidiFluor-ORANGE Zymosan A による細胞イメージング例

    AcidiFluor™ ORANGE Labeling Kit
    AcidiFluor ORANGE-NHS および AcidiFluor-ORANGE Zymosan A による細胞イメージング例

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    AcidiFluor ORANGE-NHS および AcidiFluor-ORANGE Zymosan A による細胞イメージング例

     

    A431細胞 (EGFR過剰発現細胞株) による AcidiFluor ORANGE-NHS で標識した anti-EGFR 抗体の取り込み

    anti-EGFR 抗体をAcidiFluor ORANGE-NHS と反応させ、限外ろ過により未反応色素の除去を行った。この AcidiFluor ORANGE 標識した anti-EGFR 抗体を、EGFR が過剰発現している細胞株である A431 細胞に添加し、共焦点顕微鏡にて経時的に観察を行った。抗体添加後 120 分で AcidiFluor ORANGE 由来の蛍光が検出され始め、180 分以降で高い蛍光強度が得られた。この手法により、AcidiFluor ORANGE 標識 anti-EGFR 抗体がエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、酸性化する様子をとらえることができた。

     

    AcidiFluor ORANGE ZymosanA の RAW264.7 細胞による貪食撮影例

    AcidiFluor ORANGE-ZymosanAを、RAW264.7細胞に添加し、蛍光顕微鏡にて経時的に観察を行った。AcidiFluor ORANGE-ZymosanA を取り込んだ細胞内で、蛍光強度の上昇が見られたことから、小胞の酸性化が示唆された。

よくあるご質問

  • Q pH 3以下での蛍光強度は？
    A

    AcidiFluor ORANGEのpH 3 以下での蛍光強度は、pH 3の強度とほとんど同じことがわかっています。

  • Q 固定細胞に使えますか？
    A

    基本的には固定細胞では使用できません。リソソームやエンドソームの酸性 pH は生きている細胞の活性によって酸性 pH が保たれており、固定により死んだ細胞ではその酸性が維持されなくなるためです。

    ただし、リソソームに局在する AcidiFluor ORANGE、抗体などを標識した AcidiFluor-NHS や  HaloTag に結合した HaloTag AcidiFluor ORANGE ligand の局在を知る目的で、固定後速やかに酸性 pH バッファーに置換して蛍光を確認することは可能と考えられます。

  • Q Q&A を見ても問題が解決しません
    A

    蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください

参考文献

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