DAF-2 DA (diaminofluorescein-2 diacetate)

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  DAF-2 DA (diaminofluorescein-2 diacetate)
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  検出原理

  DAF-2 DAが細胞膜を透過し、細胞内のエステラーゼにより加水分解され、細胞膜を透過しにくいDAF-2 になります。
  DAF-2 のアミノ基が NO と反応し蛍光物質が生成されます。励起波長 495 nm 付近の青色光で励起すると波長 515 nm 付近の緑色蛍光を発します。

   

  

  DAF-2 の物性

  名称	検出対象	反応	pH 範囲	Absmax (nm)	FLmax (nm)	ε	Φ
  DAF-2	NO	不可逆	>7	495	515	73,000	0.92

  スペクトル

  

  製品の性状

  DAF-2 DA 1 mg が DMSO 0.45 mL に溶解された溶液です。 
  C₂₄H₁₈N₂O₇
  MW：446.4

よくあるご質問

• Q DAF-2 DA が細胞内エステラーゼで DAF-2 に変わるにはどのくらいの時間がかかりますか？
  A

  細胞内での分解を直接測定するのは困難で、データはありません。脳組織のホモジネートを用いた予備的な検討では DAF-2 DA が10分以内に変換されました。

• Q フローサイトメーターでの測定は可能ですか？
  A

  はい可能です。下記の文献ではフローサイトメトリーへの DAF 試薬の応用が報告されています。

  Havenga, M. J. E. et al. Simultaneous Detection of NOS-3 Protein Expression and Nitric Oxide Production Using a Flow Cytometer. Anal. Biochem. 2001, 290, 283-291.

  Navarro-Antolin, J. and Lamas, S. Nitrosative Stress by Cyclosporin A in the Endothelium: Studies with the NO-Sensitive Prove Diaminofluorescein-2/ diacetate using flow cytometry. Nephrol Dial Transplant, 2001, 16 [Suppl 1], 6-9.

  Jozsef L, Zouki C, Petasis NA, Serhan CN, Filep JG. Lipoxin A4 and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 inhibit peroxynitrite formation, NF-kappa B and AP-1 activation, and IL-8 gene expression in human leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 13266-71.

• Q 手持ちのプレートリーダーは励起485nm、蛍光538nmなのですが、使用できますか？
  A

  できます。励起 495 nm、蛍光 515 nmとあるのはピークとなる波長であり、これらから若干ずれても測定できます (Anal. Chem. 1998, 70, 2450)。励起波長をピークより短めの波長で、検出波長をピークより長めの波長にするほうがバックグラウンドが低くなり、検出効率が上がる場合もあります。機器の特性にもよりますので機器のマニュアルも参照してください。

• Q 検出限界はどのくらいですか？
  A

  DAF-2 を用いた pH 7 付近のバッファー中での NO 検出限界は 5 nM と報告されています。 DAF-FM では蛍光強度は DAF-2 の 1.5 倍ありますので、若干高感度となると思われます。また DAF-2 DA や DAF-FM DA を用いて細胞内で検出する場合、細胞内の物質に妨害され感度がこれらより低下する可能性があります。

• Q 細胞毒性はありませんか？
  A

  10 μM 程度では明らかな細胞毒性は認められませんでした。万一、毒性が疑わしい場合は濃度を下げてください。

• Q 至適濃度はどの位ですか？
  A

  5 – 10 μM （500 – 1000 倍希釈）程度です。ご使用の試料・バッファーの種類により変わる場合もあります。ただし、強いシグナルを得るために試薬の濃度を上げることはフルオレセイン系化合物の性質上、逆効果のようです。

• Q NO は反応性が高い物質ですが、DAF 類は NO がどのように変化した状態を検出しているのでしょうか？
  A

  NOが速やかに酸素と反応して NO₂^－ や NO₃^－ に変化する途中の中間体と反応しています。この中間体は生理的な条件下ではNO生成がない限り生成しないため、DAF 類は NO を特異的に検出することになります。

• Q DAF-2 DA, DAF-FM DA および DAR-4M AM は細胞内にずっと留まりますか？
  A

  細胞内で分解され、膜透過性の低い DAF-2, DAF-FM または DAR-4M になりますが、少しずつ細胞外に漏れていきます。NO と反応しトリアゾール体になった後も少しずつ細胞外に漏れていきます。

• Q DAF 類は 6 種類ありますが、どのように使い分けをしたら良いですか？
  A

  第１選択としては DAF-FM （細胞外での検出）または DAF-FM DA （細胞内での検出）をお勧めします。

  DAF-2 および DAF-2 DA は実績が多いため、論文の再現実験などに使用したいといった目的の場合によく使用されます。一方、DAF-FM は pH 6-7 の範囲での特性が改善されていますので、多くの場合は DAF-FM の方をおすすめします。

  更に酸性領域での検出が必要になる可能性がある場合、もしくは緑の自家蛍光が問題になる場合等には DAR-4M AM が使用されます。

   

  型番	製品名	Exmax (nm)	Emmax (nm)	膜透過性	使用可能 pH
  SK1001-01	DAF-2	495	515	–	>7
  SK1002-01	DAF-2 DA	495	515	+	>7
  SK1003-01	DAF-FM	495	515	–	>5.5
  SK1004-01	DAF-FM DA	495	515	+	>5.5
  SK1005-01	DAR-4M	560	575	–	4-12
  SK1006-01	DAR-4M AM	560	575	+	4-12

   

• Q 亜硝酸イオン や 硝酸イオン と反応してしまうことはありませんか？
  A

  生理的な条件では亜硝酸イオン （NO₂^－）や 硝酸イオン（NO₃^－） と反応することはありません。ただし NO₂^－ が高濃度（10 mM 以上）存在して長時間インキュベートした場合には若干蛍光が出ます。

• Q これまでにどんな試料・測定法での実施例がありますか？
  A

  豊富な論文例がありますので参考文献または文献リストを参照してください。培養細胞、血管内皮細胞、海馬などの脳・神経組織、末梢血単核球、骨髄幹細胞、ミミズ神経節、植物細胞等での使用実績があります。測定法としては蛍光顕微鏡による画像観察、画像上特定点の蛍光強度測定、マルチウエルプレートリーダーによる測定等があります。

• Q 妨害物質はありますか？
  A

  フェノールレッドやビタミン類など蛍光性の物質が観察に影響する場合があります。また培地に添加される血清、BSAなどのタンパクにより NO 検出効率が低下する場合があります。

• Q 検量線を立てて定量する場合、標準物質としては何がいいですか？
  A

  厳密な定量には濃度の分かっている NO ガスの溶液を用いる必要があります。しかし実際的には、若干の誤差はありますが NONOate （１分子から２分子の NO が生成）を用いるのがよいと思われます。

• Q DAF-FM DA をバクテリア細胞内の NO 検出に使えますか？
  A

  多くのバクテリアでは細胞外に様々な酵素を分泌することが多く、DAF-FM DA のようなジアセチル化されたプローブは細胞に入る前に加水分解される恐れがあります。実際に例えば、DAF-FM DA は B. subtilis  の細胞外のエステラーゼで分解されて細胞内に入らなかったという報告もあります。一般的にジアセチル化されたプローブは真核細胞の細胞内に導入するための方法として使用されており、バクテリアでは使用が難しいと考えられます。

• Q Q&A を見ても問題が解決しません
  A

  蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください

参考文献