AcidiFluor™ Series
[リソソームのライブセルイメージングに]
570-590 nm：橙色
AcidiFluor ORANGEは、酸性環境下で蛍光が大幅に増大する蛍光母核にリソソーム局在性の構造を付加した、リソソーム染色用の蛍光プローブです。細胞外液に添加するだけで、酸性を維持している生細胞のリソソームを明瞭に観察できます。また、輝度および光安定性が高く、明瞭な蛍光を比較的長時間にわたって観察することも可能です。
AcidiFluor ORANGEは Merck KGaA (Darmstadt, Germany) からも全世界にて
SCT 019 BioTracker™ 560 Orange Lysosome Dye の名前で販売されています。
| 型番 | 製品名 | 容量 | 希望小売価格（税抜価格） |
|---|---|---|---|
| GC301 | AcidiFluor™ ORANGE | 10 μg × 20 | ￥ 68,000 |
| GC3011 | AcidiFluor™ ORANGE | 10 μg × 10 | ￥ 38,000 |
AcidiFluor™ ORANGE
製品情報
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| 名称 | 検出対象 | 反応 | pKa |
Absmax (nm) | FLmax (nm) | ε* | Φ** |
| AcidiFluor ORANGE | pH | 可逆 | 5.1 | 535 | 560 | N.D. | 0.73 |
* モル吸光係数 数値なし
** 最大量子収率 （pH によって変化する）
pH 5.0 および 7.4 の 0.1 M リン酸緩衝液中における AcidiFluor ORANGE の蛍光スペクトル。励起光波長は 532 nm。pH 5 は酸性オルガネラに、pH 7.4 はそれ以外の生理的環境に相当する。pH 5 における 568 nm の蛍光強度は pH 7.4 と比較して、50 倍以上に増大する。
AcidiFluor ORANGE は東京大学大学院医学系研究科神経生物学分野 廣瀬謙造教授のご指導の下、東京大学よりライセンスを受け、五稜化薬株式会社が製品化しました。なお本製品は、JST 先端計測分析技術・機器開発プログラムの一環として開発されました。
AcidiFluor™ ORANGE
AcidiFluor ORANGE によるイメージング例
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HeLa細胞を用いたマルチカラーイメージング例
Mitochondria-GFP （緑）を発現させた HeLa 細胞を AcidiFluor ORANGE （オレンジ）および Hoechst 33342 （青）で多重染色して蛍光顕微鏡で観察し、それぞれカッコ内の疑似カラーで重ね合わせた。
180秒間に渡る励起光照射の結果、LysoTracker® Green DND-26、LysoTracker® Red DND-99は顕著に褪色するのに対し、AcidiFluor™ ORANGEの蛍光は維持されていた。また、LysoSensor™ Green DND-189は、励起光照射により蛍光の細胞質への漏れ込みが生じたため、連続観察には適さないと考えられる。
AcidiFluor™ ORANGE
AcidiFluor ORANGE による脱顆粒現象のイメージング
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顆粒は AcidiFluor ORANGE（1 μM in DMEM）で染色し、細胞外液相は膜透過性が低い蛍光色素である Alexa Fluor® 647, carboxylic acid にて可視化した。Ionomycin を用いて脱顆粒を惹起し、共焦点顕微鏡にて観察を行った。その結果、AcidiFluor ORANGEによって染色された顆粒が、脱顆粒に伴って蛍光強度が減少し、同時に細胞外液相である Alexa Fluor® 647, carboxylic acid の蛍光強度が増大した。グラフは矢尻で示した顆粒の蛍光輝度を示したもの。
このように AcidiFluor ORANGE によって脱顆粒イメージングが可能である。
AcidiFluor ORANGE で染色した RBL-2H3 細胞（ラット好塩基球性白血病細胞）の脱顆粒イメージング。動画は、微分干渉像との重ねあわせ。Ionomycin を用いて脱顆粒を惹起し、共焦点顕微鏡にて観察を行った。その結果、AcidiFluor ORANGEによって染色された顆粒が、脱顆粒に伴って蛍光強度が減少したことが確認された。
基本的には固定細胞では使用できません。リソソームやエンドソームの酸性 pH は生きている細胞の活性によって酸性 pH が保たれており、固定により死んだ細胞ではその酸性が維持されなくなるためです。
ただし、リソソームに局在する AcidiFluor ORANGE、抗体などを標識した AcidiFluor-NHS や HaloTag に結合した HaloTag AcidiFluor ORANGE ligand の局在を知る目的で、固定後速やかに酸性 pH バッファーに置換して蛍光を確認することは可能と考えられます。
蛍光色素一般に関する Q&A も参照してください
T. Karasawa, A. Kawashima, F. Usui-Kawanishi, S. Watanabe, H. Kimura, R. Kamata, K. Shirasuna, Y. Koyama, A. Sato-Tomita, T. Matsuzaka, H. Tomoda, S. Y. Park, N. Shibayama, H. Shimano, T. Kasahara, M. Takahashi (2018)
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K. Kitakaze, Y. Mizutani, E. Sugiyama, C. Tasaki, D. Tsuji, N. Maita, T. Hirokawa, D. Asanuma, M. Kamiya, K. Sato, M. Setou, Y. Urano, T. Togawa, A. Otaka, H. Sakuraba, K. Itoh (2016)
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Nat. Commun. 5: 4519 DOI:10.1038/ncomms5519
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