よくある質問

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AcidiFluor™ ORANGEに関するQ&A

残念ながら固定した細胞に対する使用はできません。
理由としましては、細胞を固定することにより酸性小胞内の酸性環境が維持されなくなり、
AcidiFluor ORANGEが光らなくなると想定されるからです。
酸性小胞内の酸性環境は細胞が生きているからこそATPをエネルギー源として実現できる環境のようです。

リソソームのイメージングやアプリケーションノートに示しましたRBL-2H3細胞(ラット好塩基球性白血病細胞)の脱顆粒観察のほか、好中球やインスリノーマなど、分泌系細胞のエキソサイトーシスイメージングにご利用いただけます。アプリケーション例が整い次第、アプリケーションノートに公開致します。

pH 3.0からpH 8.0 の溶液中で測定した蛍光スペクトルを下図に示します。pHが小さくなるに従い蛍光強度が上昇することがわかります。

                   

AcidiFluor™ ORANGE-NHS(GC302)を使用することで、酸性オルガネラに取り込まれると蛍光を発するタンパク質を作製することが可能になります。

AcidiFluor™ ORANGEのpH 3以下での蛍光強度は、pH 3の強度とほとんど変化しないことがわかっています。

AcidiFluor™ ORANGE-NHS に関するQ&A

下記公式により求めることが出来ます。

AcidiFluor™ ORANGE-NHSの濃度(分子)を、タンパク質の濃度(分母)で割ることで、「タンパク質1分子あたりに標識されたAcidiFluor™ ORANGE-NHSの分子数」を算出します。

A544, 280 : 標識体の 544 nm、280 nm における吸光度

CF : Correction Factor (0.12)

εAcidiFluor ORANGE-NHS : AcidiFluor™ ORANGE-NHS のモル吸光係数 (80,000)

εprotein : 標識タンパク質 のモル吸光係数  (IgG の場合、216,000)

残念ながら固定した細胞に対する使用はできません。
理由としましては、細胞を固定することにより酸性小胞内の酸性環境が維持されなくなり、
AcidiFluor ORANGEが光らなくなると想定されるからです。
酸性小胞内の酸性環境は細胞が生きているからこそATPをエネルギー源として実現できる環境のようです。

標識する抗体等、タンパク質は精製されたものを使用することをお勧めします。もし未精製のタンパク質に標識したい場合は、一度限外ろ過やゲルろ過などで夾雑物を除いた後に標識を行ってください。Trisなどアミノ基を含む物質が残存していると、そちらとも色素が反応するため、アミノ基を含まないリン酸緩衝液またはGood buffers (PIPES, HEPES 等)をご使用ください。

残念ながら、AcidiFluor™ ORANGE-NHS標識をしたタンパク質を取り込ませた後、細胞を固定すると蛍光を検出することは難しいです。細胞を固定することにより酸性小胞内の酸性環境が維持されなくなり、AcidiFluor™ ORANGE-NHSが光らなくなると想定されるからです。

炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) を 0.1 M になるように純水に溶解してください。およそ pH 8.0から8.4 程度になるはずですのでそのままお使いください。pH が外れている場合は、Na2CO3 や HCl などで微調整していただいても構いません。

NHS エステルと1級アミンの反応はpH 8.0から 8.6 付近で効率よく進行します。そのため、Tris buffer などのアミノ基を含むバッファー以外であれば、HEPES, リン酸バッファー、ホウ酸バッファーなども同様に使用可能です。

タンパク質の 280 nm で吸光度は、Gill and von Hippel (1989) Analytical Biochemistry, 182: 319-326 や Anthis and Clore (2013) Protein Science 22:851-858などの方法で求めることができます。以下のような Web サイトでも計算サービスが提供されているようですが、ご利用にあたってはそれぞれのサイトの利用条件などの説明に従ってください。

http://protcalc.sourceforge.net/
http://web.expasy.org/protparam/
http://nickanthis.com/tools/a205.html

CaSiR-1™ / CaSiR-1™ AM に関するQ&A

AMとはアセトキシメチル基のことで、AM体は細胞膜の透過性を付与するために誘導体化された化合物です。

下図のように、CaSiR-1™ AMは細胞膜を通過し、細胞内のエステラーゼの働きでアセトキシメチル基が切断されることでカルシウムと相互作用できる構造、CaSiR-1となります。また、アセトキシメチル基が切断されると水溶性が大きく向上し、細胞外へ漏れ出しにくくなります。

1 mM 以下のMg2+ や 100 mM 以下の Na+、K+ 存在下ではほとんど発光しないことがわかっています。詳しくは下記の参考文献をご参照ください。

参考文献:Egawa, T.; Hanaoka, K.; Koide, Y.; Ujita, S.; Takahashi, N.; Ikegaya, Y.; Matsuki, N.; Terai, T.; Ueno, T.; Komatsu, T.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 14157-14159

CaSiR-1™ AM だけでなくほとんどのAM体は非常に脂溶性が高く、DMSOに溶解してそのまま緩衝液に分散させると凝集してしまい、細胞内へ取り込まれにくくなります。そこで界面活性剤の添加や、場合によってはさらに超音波処理を行うことによって、細胞に取り込まれやすい染色液を作る必要があります。

ただし、CaTM-3 AMは水溶性が高いため、多くの場合はPluronic F-127 などの界面活性剤の添加が不要です。

現在のところ細胞毒性試験を行っておりませんが、今後MTS assayを用いて他社品との毒性比較を予定しております。測定次第、HPにアップロード致します。

また、励起光の毒性という観点からは、短波長励起>長波長励起 というように小さくなりますので、青、緑、赤色のカルシウムプローブよりも細胞に障害を起こしにくいと考えられます。

POLARIC™ に関するQ&A

相性が違うから

POLARIC™(ポラリック)蛍光色素は溶かす溶液によって色が変わります。それをソルバトクロミズムと呼びます。(左絵)

溶液には極性と呼ばれる指標があり、単純に水に近いか、油に近いかで、 POLARIC™蛍光色素との相性が決まります。この相性の違いが、サラダ油では青、お酒では緑、水では赤といったような、溶かしたPOLARIC™蛍光色素の色を変化させてしまうのです。

このPOLARIC™蛍光色素との相性の違いが色変化で表示できる性質を利用すれば、温度変化や圧力変化、またpH変化や固さの変化など身の回りの様々な現象をPOLARIC™蛍光色素の色変化で置き換えることができます。

光吸収により励起されたPOLARIC™(ポラリック)蛍光色素は、取り囲んでいる溶媒分子の再配向により励起状態の安定化を受ける。励起状態の色素分子は電荷が大きく局在化しているため、非極性溶媒よりも極性溶媒の方が安定化の効果が大きくなる。この安定化の効果の違いが蛍光波長の違いとして現れる。

図1. ヤブロンスキーダイアグラムと溶媒際配向の模式図

表1に各溶媒のET(30)値を示す。図2のように各溶媒にPOLARIC™を溶かすと、左から右に向かって青色から黄色に変化する。これは上述の説明の通り、ET(30)値が小さいと短波長、値が大きいと長波長になるためである。

表1. 各溶媒のET(30)値

 

溶媒CyclohexaneTolueneDioxaneTHFEthyl
acetate
CHCl3CH2Cl2AcetoneDMFDMSO
ET(30)値30.933.93637.438.139.141.142.243.245.1

 

図2. POLARIC™を溶解させた各溶媒のUV撮影像

光の強さと色が同時に変わります。

濃度の違いに応じて・・・

普通の色素は、濃度などに応じて光の強さのみしか変化しませんが、POLARIC™(ポラリック)蛍光色素を用いれば光の強さはもちろん変わるし、色も同時に変わります。

このPOLARIC™(ポラリック)蛍光色素の利点は、

  1. 色が変わるので視認性が格段に上がる。
  2. 色が変わるので定量性が増す。
  3. 色が変わるので濃度分布を反映したマルチカラーイメージングが可能。

です

有機物を作るための安全で便利な道具

有機物は生物の体を形作っているのはもちろんのこと、医薬や衣服、プラスチックなど日常の生活に欠かすことのできないものです。つまり“有機物を作る”ことはとても重要なことなのです。

料理をする際には包丁やまな板、鍋など様々な調理道具が必要になるように、有機物を作る際にも様々な“道具(反応)”が必要になります。北海道大学の鈴木章先生らによって生み出されたこの道具(反応)は、物と物をくっつける役割を果たし、それまでのものよりずっと安全でかつ便利であったことから、様々な有機物を作るため世界中で使われています。

この人類の生活に欠かすことのできない有機物を生み出す道具(反応)の開発は、人類に多大な恩恵をもたらしたことから2010年にノーベル化学賞を受賞しました。

POLARIC™は、まわりの脂質の組成によって蛍光波長が変化することがわかっています(Chem. Lett. 2011, 4, 989-991)が、 pHによる大きな蛍光波長変化はありません。

POLARIC™の構造自体が脂質類似の構造なので、色素の親水性部位と疎水性部位が脂質のそれらと同様の配置・配向をとり、さらに色素が単分散することでその配置の状況に応じた蛍光を生じると考えられます。

DAF類、HPF、APF に関するQ&A

NOが速やかに酸素と反応して NO2- や NO3- に変化する途中の中間体と反応しています。この中間体は生理的な条件下ではNO生成がない限り生成しないため、DAF類はNOを特異的に検出することになります。

生理的な条件ではこれらと反応することはありません。但しNO2- が高濃度(10mM以上)存在して長時間インキュベートした場合には若干蛍光が出ます。

DAF-2を用いたpH 7 付近のバッファー中でのNO検出限界は 5 nM でした。DAF-FMでは蛍光強度はDAF-2の1.5倍ありますので、若干高感度となると思われます。

フェノールレッドやビタミン類など色素性の物質により蛍光強度が減弱する場合があります。又培地に添加される血清、BSAなどのタンパクによりNO検出効率が低下する場合があります。

いいえ。DAF試薬とNOの反応により産生される蛍光性化合物は安定な物質なので蓄積性のシグナルを見ていることになります。従って、NOが減った場合は蛍光の増加が止まるだけで低下はしません。すなわち蛍光強度増加曲線の傾きがNO産生量を示します。

細胞膜透過性のないタイプの試薬(DAF-2, DAF-FM, DAR-4M)により細胞外NOを定量することは可能です。NO濃度既知の溶液で検量線を作製しそれを基準として下さい。細胞内に入るタイプの試薬(DAF-2 DA, DAF-FM DA, DAR-4M AM)では正確な定量は困難です。細胞内環境の違いによりDAF試薬がNOを検出する反応効率・量子収率が変化するからです。

厳密な定量には濃度の分かっているNOガスの溶液を用いる必要があります。しかし実際的には、若干の誤差はありますがNONOate(1分子から2分子のNOが生成)を用いるのがよいと思われます。

10μM程度では明らかな細胞毒性は認められませんでした。万一、毒性が疑わしい場合は濃度を下げてお試し下さい。

5~10μM(500~1000倍希釈)程度です。ご使用の試料・バッファーの種類により若干変わってくる場合もあります。ただし、強いシグナルを得るために試薬の濃度を上げることはフルオレセイン系化合物の性質上、逆効果のようです。

細胞内での分解を直接測定するのは困難なので直接測定したデータはないのですが、脳組織のホモジネートを用いた検討では DAF-2 DA が10分以内に分解されました。

細胞内に入った後、エステラーゼにより分解されDAF-2、DAF-FMになりますが少しずつ細胞外に漏れていきます。また、NOと反応しDAF-2Tになった後も少しずつ細胞外に漏れていきます。

材料としては培養細胞、血管内皮細胞、海馬などの脳・神経組織、末梢血単核球、骨髄幹細胞、ミミズ神経節、植物細胞等があります。測定法としては蛍光顕微鏡による画像観察、画像上特定点の蛍光強度測定、マルチウエルプレートリーダーによる測定等があります。

はい可能です。下記の文献ではフローサイトメトリーへのDAF試薬の応用が報告されています。

  1. Havenga, M. J. E. et al. Simultaneous Detection of NOS-3 Protein Expression and Nitric Oxide Production Using a Flow Cytometer. Anal. Biochem. 2001, 290, 283-291.
  2. Navarro-Antolin, J. and Lamas, S. Nitrosative Stress by Cyclosporin A in the Endothelium: Studies with the NO-Sensitive Prove Diaminofluorescein-2/ diacetate using flow cytometry. Nephrol Dial Transplant, 2001, 16 [Suppl 1], 6-9.
  3. Jozsef L, Zouki C, Petasis NA, Serhan CN, Filep JG. Lipoxin A4 and aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 inhibit peroxynitrite formation, NF-kappa B and AP-1 activation, and IL-8 gene expression in human leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 13266-71.

できません。

生体内環境でのNO の半減期は1秒程度と考えられます。そのため、固定後のサンプルには固定前に発生した NO は残存しておらず、検出することもできません。生細胞や生体組織での使用をお願いします。

できます。励起495nm、蛍光515nmとあるのは効率ピークとなる波長であり、これらから若干ずれても測定できます (Anal. Chem. 1998, 70, 2450)。また夾雑物質によるバックグラウンドがある場合に、長波長で(蛍光530nm)測定したら感度・直線性がよくなったという経験があります。

はい、できます。もちろんボトムリードタイプでも可能です。

DAF類の細胞内取り込速度の測定データがあるわけではないのですが、例えばラット大動脈平滑筋細胞へのDAF-2 DAローディングには1時間 (Kojima, H. et al. Chem. Pharm. Bull, 1998, 46, 373-75)、ウシ大動脈由来の内皮細胞 primaly culture への DAR-4M AM ローディングには30分 (Kojima, H. et al. Anal. Chem. 2001, 73, 1967-73)で行っています。既存の報告例を元にご自身の系でご検討下さい。

APFのほうがHPFより感度が良いです。HPFはヒドロキシラジカルとパーオキシナイトライトと反応しますが、APFは次亜塩素酸イオンとも反応します。

両方とも細胞膜を通過します。よって細胞内のイメージングにもご使用できます。

まず凍結融解は避けて下さい。DAF試薬類の包装単位は 1 mg となっていますが、1 mg が0.5 ml程度のDMSOに溶けた溶液となっています。凍結融解を繰り返すとDMSOが水分を取り込んで品質が劣化します。最初の開封時に小分けして保存し、以後は使用ごとに使いきりとされることをお勧めします。又、同じく吸湿を避けるため、冷蔵庫から出したら十分に放置して、バイアル全体が室温になってから開けて下さい。

ROSFluor™ に関するQ&A

DMSO はヒドロキシラジカルのクエンチャーになることが知られています。そのため、これらの試薬がヒドロキシラジカルまたはヒドロキシラジカルの影響で増加する ROS を検出しづらくなることが予想されるため、溶媒として DMF を推奨しています。

MetalloFluor に関するQ&A

FeRhoNox-1 の溶媒として dimethyl sulfoxide (DMSO) を推奨しています。DMSO は infinity pure, ultra-pure などと表示されているできるだけ純度の高いものを準備し、開封後すぐにご使用ください。すぐに使用しない場合は、吸湿しないように分注して超低温フリーザーで保管しておくことをお勧めします。
理由として、DMSO は劣化すると硫化メチルなどの分解物が生成しますが、この分解物によって FeRhoNox-1 の蛍光バックグラウンドが上昇することがあるためです。

パラフィン切片での使用は基本的にはできないとお考えください。
組織切片の鉄イオン検出には、凍結切片を軽くホルマリンで固定する方法が報告されています。以下の論文をご参照ください。
Mukaide et al., (2014) Histological detection of catalytic ferrous iron with the selective turn-on fluorescent probe RhoNox-1 in a Fenton reaction-based rat renal carcinogenesis model
Free Radical Research 48:990-995
http://dx.doi.org/10.3109/10715762.2014.898844

蛍光観察一般 に関するQ&A

ほとんどの場合問題ありません。
特に ROS 検出用プローブの場合、細胞によっては飢餓状態で ROS が増加する場合がありますので、 HBSS などの緩衝液ではなく、細胞培養用培地に蛍光プローブを添加する方が良い場合もあります。ただ、製品によっては培地中の成分が検出に影響を及ぼす場合がありますので、取扱説明書や文献の情報に従ってください。

目的の物質と反応する前はほとんど蛍光を発しない高性能の蛍光プローブの場合、必ずしも観察の前の溶液交換は必要ありません。培地中に未反応で無蛍光のプローブが存在した状態でシグナルのみを検出できます。ただし、細胞培養用培地中で蛍光プローブを投与した場合、培地に含まれる蛍光物質を除去するために溶液交換が必要になる場合もあります。特にフェノールレッドを含んだ細胞培養用培地は蛍光を発するため、蛍光観察を妨げることがあります(下図参照)。この場合、フェノールレッド不含の培地を使用することで溶液交換せずに観察できます。これらの溶液条件については、目的の細胞や培地に合わせて予備実験を行った上で決定されることをお勧めします。

それぞれの波長(スリット幅 20 nm)で励起したときのDMEM 培地の蛍光スペクトル。青色光で励起したときに、緑から赤の蛍光が観察されます。

一般的な生物用の顕微鏡レンズは、厚さ 0.17 mm のカバーガラスの光学特性を想定して設計されています。(一部のレンズには、ガラスの厚み誤差を補正するための補正環がついているものもあります。)そのため、一般的な倒立型の蛍光顕微鏡を用いる場合は、No.1 または No. 1s と呼ばれるカバーガラス、または同等のガラスを使用するのが適しています。

培養細胞を蛍光顕微鏡観察する場合、細胞培養用のプラスチック製のプレートの底の中央部がカバーガラスと同様のガラスでできている「ガラスボトムディッシュ」を用いるのが一般的です。同様にガラスボトムのマルチウェルプレートなども使用可能です。使用される場合は、顕微鏡にそれらのプレートなどが設置できるアタッチメントがあることもご確認ください。

近年ではプラスチックでもガラスと同じ屈折率、光学的な均質さを実現した顕微鏡観察用のプラスチックボトムのディッシュやマルチウェルプレートも販売されています。これらの素材はガラスと同様に自家蛍光が少なく、蛍光観察が可能になっています。

一方、一般に細胞培養などに使用される培養用ディッシュ(培養皿)やフラスコには自家蛍光があったり、または光学的に均質でない素材からできているものなどがあるため、ほとんどの場合、蛍光顕微鏡での観察に適しません。ご注意ください。

アクティベイタブル型の蛍光プローブをパラフィン切片で使用することは、一般的にはできないと考えてください。(STELLA™ Fluorで標識した蛍光2次抗体はアクティベイタブル型の蛍光プローブではないため使用可能です。)

また、固定細胞での使用も注意が必要です。アクティベイタブル蛍光プローブは、多くの場合、細胞内のイオンや活性酸素などと反応しますが、これらの局在や濃度などは、生きている細胞の活性によって保たれています。これらが固定後にも保たれているかどうかは観察の目的や固定の方法によって異なります。また、細胞の酵素活性を検出するタイプの蛍光プローブでは、固定により、酵素活性が低下または消失することが多いため、固定条件について十分な検討が必要になります。

生細胞での反応後に軽く固定する場合は、蛍光が保たれやすくなりますが、アルコールなどにより膜透過処理を行うと、蛍光強度の低下や細胞内での局在に大きく影響することが多くなります。

一般的には、まず生細胞と固定細胞で結果を比較し、固定による反応性や蛍光強度の低下やアーティファクトについての予備検討後に実験にご使用ください。

各製品のプロトコル推奨の溶媒を使用してください。多くの蛍光プローブは、最初に dimethyl sulfoxide (DMSO) または N,N-dimethylformamide (DMF)に溶解してからバッファー溶液などの水溶液で希釈します。水溶性が高くない物質は、ミリモルオーダーの水溶液を作るのが難しかったり、最初に有機溶媒に溶かしたほうが安定した水溶液を作成できるためです。

一級アミンと反応するNHS は水溶液中で分解やすいため、まずは脱水した DMSO に溶解してから、pH 8.4 前後の溶液に溶かしたタンパク質などとすみやかに混合しながら反応させてください。脱水 DMSO は試薬として販売されているほか、高温、減圧条件で乾燥させたモレキュラーシーブス 3A を添加して脱水することもできます。

有機溶媒は一般に長期間保存すると空気中の水分を吸ったり、酸化や紫外線の影響などで品質が低下します。品質が低下した溶媒を用いると、蛍光のバックグラウンドが上昇したり、反応性が低下することがあります。DMSO の場合はできるだけグレードの高いものを開封後すぐに分注して超低温フリーザーで保管すると比較的長く品質を保つことができるようです。この場合、吸湿させないために分注はなるだけ乾燥した環境で行い、また開封前に完全に室温に戻すようご注意ください。DMF についても湿気、高温、紫外線を避けて保管し、開封後はできるだけ早くご使用ください。

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