HYDROPを用いた生細胞でのH2O2 検出例

※ 以下で HYDROP のストック溶液、の記載は HYDROP 1バイアル (30 nmol) を DMF 30 μLに溶解させた 1 mM 溶液のことです。

RAW264.7細胞のH2O2 産生の測定

  1. RAW264.7細胞 (5×104 cell/mL) を播種し、無血清DMEMにて、37℃, 5% CO2存在下で一晩培養する。
  2. HYDROPのストック溶液を無血清DMEMで希釈し、終濃度1 μM の染色液を作成する。
  3. 2にROS阻害剤をそれぞれ加える (Apo; Apocynin 終濃度 5 mM, Ebs; Ebselen 終濃度 5 μM, NAC; N-acetyl-L-cysteine 終濃度 10 mM)。
  4. 培養細胞より液体培地を除去し、HBSSで1回洗浄を行う。
  5. 培養容器に 染色液を加え、37℃, 5% CO2 存在下で20分間インキュベートする。
  6. 無血清 DMEM に溶かしたPMA (Phorbol Myristate Acetate 終濃度1 ng/mL) を加え、37℃, 5% CO2存在
    下で30分間インキュベートする。
    ※ 各細胞により適切なPMA濃度は異なるため、最適化が必要です。
  7. 培養容器から液体培地を除去し、HBSSで2回洗浄を行った後、新しいHBSSに置き換える。
  8. 蛍光顕微鏡で観察する。(GFP用バンドパスフィルタ等を使用)

PMAを加えたRAW264.7 細胞は、刺激していない細胞 (上段左図) に比べ、HYDROP由来の斑点状のシグナルが多く検出された。さらに、蛍光強度も高いことから、H2O2 産生量が多いことが分かる。また、ROS阻害剤を加えたことにより (下段) 、それぞれH2O2 産生が抑制されている。(スケールバーは25 μm)

観察条件: Leica DMI 6000 CS, objective lens: 20×, filter cube: L3 (ex. 450-490, em. 527-530 BP)

HeLa細胞のH2O2産生の測定

  • 1. HeLa細胞 (5×104 cell/mL) を播種し、DMEM (8% FBS, PS) 、37℃, 5% CO2 存在下で一晩培養する。
  • 2. 培養細胞より液体培地を除去し、HBSSで1回洗浄を行う。
  • 3. コントロールは DMEM (8% FBS, PS)に、飢餓状態にする細胞は EBSS (Earle’s Balanced Salt Solution)
  • 4. に置き換え、37℃, 5% CO2存在下で2時間インキュベートする。
  • 5. 抗酸化剤を添加する場合は、NAC (N-acetyl-L-cysteine, 終濃度 10 mM) 添加DMEM (8% FBS, PS) を加え、37℃, 5% CO2 存在下で10分間プレインキュベートし、その後 NAC を含む EBSS または DMEM (8%FBS, +PS) に置き換え、37℃ 5% CO2 条件で2時間培養する。
  • 6. HYDROPのストック溶液をEBSSあるいはDMEM (8% FBS, PS) で希釈し、終濃度5 μM の染色液を作成する。
  • 7. 培養容器から液体培地を除去し、HBSSで2回洗浄を行う。
  • 8. 培養容器に染色液を加え、37℃, 5% CO2 存在下で30分間インキュベートする。
  • 9. 培養容器から染色液を除去し、HBSSで2回洗浄を行った後、新しいHBSSに置き換える。
  • 10. 蛍光顕微鏡で観察する。(GFP用バンドパスフィルタ等を使用)

EBSSによって飢餓状態になったHeLa細胞は H2O2 を産生することが知られている (Scherz-Shouval, 2007 EMBO J. 26:1749-1760)。 EBSS で培養した細胞 (左) では、DMEM (8% FBS, PS) で培養した細胞 (右) に比べ HYDROP 由来のシグナルが強く、 H2O2 をより多く産生していることが分かる。

また、両細胞とも、NAC添加により H2O2 産生が抑制されている (下段)。(スケールバーは50 μm)

観察条件: Leica DMI 6000 CS, objective lens: 20×, filter cube: L3 (ex. 450-490, em. 527-530 BP)

A431細胞のH2O2産生の測定

  • 1. A431細胞を播種し、DMEM (8% FBS, PS) で 約60% confluentになるまで2~5日間インキュベートする。
  • 2. 培地を無血清DMEMに置き換え、37℃, 5% CO2存在下で一晩培養する。
  • 3. HYDROP (終濃度 5 μM) および、必要に応じて活性酸素インヒビター apocynin (終濃度 5 mM), ebselen (終濃度 5 μM) を無血清DMEMに加え、染色液を作成する。
  • 4. 培養細胞より液体培地を除去し、HBSSで1回洗浄を行う。
  • 5. 培養容器に 染色液を加え、37℃, 5% CO2存在下で10分間インキュベートする。
  • 6. 培養容器から染色液を除去し、HBSSで2回洗浄を行う。
  • 7. EGF (終濃度500 ng/ml) を含む無血清DMEMを加え、37℃, 5% CO2存在下で30分間インキュベートする。
  • 8. 培養容器から液体培地を除去し、HBSSで2回洗浄を行った後、新しいHBSSに置き換える。
  • 9. 常法にて観察する。(GFP用バンドパスフィルタ等を使用)

EGFを加えて刺激した A431細胞 (2段目) は、刺激していない細胞 (上段) に比べ、HYDROP由来のシグナルがより強く検出され、H2O2 産生量が多いことが分かる。また、ROSインヒビターを加えたことで(3、4段目) H2O2 産生が抑制されている。(スケールバーは50 μm)

観察条件: NIKON Ti-E, objective lens: 40×, filter cube: GFP-HQ (ex. 457-487, em. 500-545 BP)

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