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【ヒトiPS細胞・ヒトES細胞検出用蛍光試薬】
Kyoto Probe 1(KP-1)

  • ヒトiPS細胞・ヒトES細胞と分化細胞を識別可能
  • フローサイトメトリーや、ライブセルイメージングが可能
  • 染色状態で培養可能

λex 515 nm

λem 529 nm

Φ 0.45

図1 KP-1の蛍光特性
図1 KP-1の蛍光特性

KP-1の特長

1.ヒトiPS細胞・ヒトES細胞と分化細胞と識別可能

図2 (A、B) フィーダー細胞上に形成しているヒトiPS 細胞のコロニーを、KP-1 を用いて蛍光染色した写真。

図2 (A、B) フィーダー細胞上に形成しているヒトiPS 細胞のコロニーを、KP-1 を用いて蛍光染色した写真。(左: 明視野像、右: 蛍光像、スケールバー: 300μm)
KP-1によるヒトiPS/ES細胞への特異的染色のメカニズム

KP-1によるヒトiPS/ES細胞への特異的染色のメカニズム

KP-1は細胞膜透過性があり、ヒト幹細胞にKP-1を添加すると自動拡散により細胞内のミトコンドリアに集積し、細胞膜上のABCタンパク質の発現量が低いため細胞外へ排出されずにミトコンドリアに電位非依存的に局在し続ける。一方、分化細胞においても同様に、KP-1は細胞内へ取り込まれるが、ABCB1およびABCG2の作用により細胞外へ排出されてしまう。この結果、KP-1の濃度がヒト幹細胞内では高く、分化細胞では低くなるため蛍光強度の差が生じると考えられる(Cell Rep. 2014)。

図3 (C、F) KP-1 を用いて部分的に分化したヒトiPS細胞のコロニーを蛍光染色した写真。

図3 (C、F) KP-1 を用いて部分的に分化したヒトiPS細胞のコロニーを蛍光染色した写真。(C: 明視野像、F: 蛍光像、スケールバー: 450 μm). 外側の未分化状態にあるヒトiPS細胞のみが蛍光染色される。(D、G) KP-1を用いてヒトES細胞のコロニーが蛍光染色されている。(D: 明視野像、G: 蛍光像、スケールバー: 450 μm). (E、H) KP-1を用いて部分的に分化したヒトES細胞のコロニーを蛍光染色した写真。(E: 明視野像、H: 蛍光像、スケールバー: 450 μm). 分化した細胞中では蛍光が観察されない。
2.フローサイトメトリーや、ライブセルイメージングが可能

図4 iPS細胞のFACS解析
図4 iPS細胞のFACS解析

(左)ヒトiPS細胞とフィーダー細胞を混合したものに対して、多能性幹細胞マーカーであるSSEA-4陽性の細胞の多くが、KP-1も陽性になることが確認された。
(右)ヒトiPS細胞の99.18%がKP-1によって染色されることが確認された。
3.フローサイトメトリーを用いたヒトiPS細胞の分離

図5 各種ヒト体細胞のKP-1によるフローサイトメトリー
図5 各種ヒト体細胞のKP-1によるフローサイトメトリー

肺などのヒト体細胞に対してKP-1でのフローサイトメトリーを行った結果、神経細胞を除く体細胞において分離が可能。
[詳細]分化と未分化細胞認識のメカニズム
KP-1はヒト幹細胞においてミトコンドリアに局在を示し、蛍光強度の差はミトコンドリアに関係することが示唆される。
一方で、分化誘導前後でABCタンパク質の発現量が増減するという現象が報告されており、ABCタンパク質の中で化合物の輸送に関係するタンパク質に着目したところ、分化誘導後にABCB1とABCG2のメッセンジャーRNAの発現量が大きく増加することが発見された。そこで、ABCB1およびABCG2を発現するモデル細胞に対してのKP-1を加えて蛍光発光の変化について測定を行った。ABCタンパク質の発現量が少ないKB3-1細胞を用いて遺伝子改変によってABCB1およびABCG2を過剰に発現する細胞を構築し、これらの細胞にKP-1を加えて観察したところ、いずれの細胞においても蛍光発光は観察されなかった。しかし、これらの細胞に、ABCB1とABCG2の活性を抑制する阻害剤であるサイクロスポリンA(CsA)およびフミトレモルギンC(FTC)を添加すると、KP-1の蛍光発光が観察された。以上の結果から、KP-1はABCB1とABCG2の基質となり、これらのタンパク質の作用によって細胞内から排出されることが示唆される。
続いて、ヒトES細胞と分化細胞をそれぞれKP-1で蛍光染色し、フローサイトメーターによる解析を行った結果、ヒトES細胞中の蛍光発光強度は分化細胞に比べて約100倍程度強いことが明らかとなった。しかし、分化細胞をABCB1とABCG2の阻害剤であるCsAおよびFTCで処理すると分化細胞中でも蛍光強度の増加が確認された。以上の結果から、KP-1の蛍光挙動は細胞膜上に発現するABCB1およびABCG2に依存することが示唆される。(「KP-1によるヒトiPS/ES細胞への特異的染色のメカニズム」の項の図を参照)。
参考文献
Ting-Fang Kuo, Di Mao, Nao Hirata, Bilon Khambu, Yasuhisa Kimura, Eihachiro Kawase, Hiroki Shimogawa, Makoto Ojika, Norio Nakatsuji, Kazumitsu Ueda, and Motonari Uesugi.
Selective Elimination of Human Pluripotent Stem Cells by a Marine Natural Product Derivative J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (28), pp 979-9801
Hirata N, Nakagawa M, Fujibayashi Y, Yamauchi K, Murata A, Minami I, Tomioka M, Kondo T, Kuo TF, Endo H, Inoue H, Sato S, Ando S, Kawazoe Y, Aiba K, Nagata K, Kawase E, Chang YT, Suemori H, Eto K, Nakauchi H, Yamanaka S, Nakatsuji N, Ueda K, Uesugi M. Cell Rep. 2014 6:1165-1174.
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型番 名称 容量 希望小売価格(円) プロトコル MSDS
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