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【hROS 検出用オレンジ色蛍光プローブ】
OxiORANGE™

OxiORANGE™ はヒドロキシラジカル (OH) および次亜塩素酸(HClO) と反応してオレンジ色の蛍光を発する蛍光プローブです。赤に近い蛍光波長を持つため、GFP や Hoechist 33342 などの蛍光と区別することが可能です。
正電荷を持つためミトコンドリアに局在しやすい性質があります。光褪色にも強く、生細胞のイメージングに最適です。

特徴

  • 活性酸素種 (OH, O2−・,HClO, H2O2, NO, ONOO など) の中でも、hROS と呼ばれる反応性の高いヒドロキシラジカル (OH) および次亜塩素酸 (HClO) を検出できます。スーパーオキシド、過酸化水素、一酸化窒素、パーオキシナイトライトでは蛍光強度の増加が見られません。
  • 比較的強い蛍光を示し、光褪色にも強いため、細胞内の hROS 産生のタイムラプスイメージングに適します。
  • オレンジ色の蛍光を示すため、緑や青色、長波長赤色などの蛍光色素とのマルチカラーイメージングが可能です。
  • 細胞内ではミトコンドリアに蓄積し、高い細胞内滞留性を示します。
  • ROS との反応後に固定しても蛍光が保たれます。(3-4% 以下のパラホルムアルデヒド)

測定原理

OxiORANGE™ は中性水溶液中でほとんど蛍光を発しませんが、OH または HClO と反応すると、強蛍光化合物に変化し (励起最大波長 553 nm、蛍光最大波長 577 nm) 、蛍光強度の増大が観測されます。 細胞膜透過性が高く、細胞内では膜電位によってミトコンドリアに蓄積します。  

OxiORANGE™ の性質

図1. 吸光および蛍光スペクトル(左)と活性酸素種に対する反応選択性(右)
図1. 吸光および蛍光スペクトル(左)と活性酸素種に対する反応選択性(右)

OHとの反応前に比べ、反応後はおよそ30倍の蛍光が検出されます。

スペクトル(左)測定条件
  • OxiORANGE™ (最終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、NaOCl (終濃度5 μM) を加え、スペクトルを測定した。
  • 励起波長553 nm、slit width 2.5mm, photon multiplier voltage 700V.
反応選択性測定条件(右)
  • OxiORANGE™ (終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、以下の活性酸素種生成系を添加 (最終濃度)。
  • 励起波長553 nm、測定波長577 nm, slit width 2.5mm, photon multiplier voltage 700V.
各活性酸素種生成条件

OH: 過塩素酸鉄 (II) 300 μM, H2O2 1 mM, RT, 5 min
ONOO-: ONOO- 50 μM, RT, 5 min
HClO: NaOCl 50 μM, RT, 5 min
NO: NOC18 5 μM, 37℃, 30 min
O2-・: KO2 100 μM, 37℃, 30 min
H2O2: H2O2 100 μM, 37℃, 30 min

特徴1. 明るく観察しやすい蛍光

図2. ミトコンドリア局在性の酸化ストレス検出プローブ比較。
図2. ミトコンドリア局在性の酸化ストレス検出プローブ比較。

OxiORANGE™(上段), 他社製品A(中段), 他社製品B(下段)各 1 μM を添加した培地中でRBL-2H3 細胞を15分インキュベートしたのち洗浄し、0.5 μM H2O2 を加えて ROS 産生を誘導した直後(左)と20分後(右)。照明光強度と露出条件を揃えて撮影。それぞれ異なる酸化ストレス物質を検出する試薬ではあるが、一般的な酸化ストレス検出用途としてはOxiORANGE™ の蛍光は明るくて観察しやすいことがわかる。
また、製品B は時間経過とともに核内へ移行するのが観察されたが、OxiORANGE™ では局在の大きな変化は観察されなかった。
使用顕微鏡: NIKON Eclipse Ti, (PlanFluor 40×0.75), HAMAMATSU ORCA-R2

図3. 活性酸素種検出試薬の比較。
図3. 活性酸素種検出試薬の比較。

OxiORANGE™ (1 μM, 上段)または他社製品C (5μM, 下段) を培地に添加して30分間インキュベートした HeLa 細胞を、洗浄し、1 mM H2O2 を加えて刺激しROS産生を誘導した。製品C でも蛍光の増加が認められたが、OxiORANGE™ では刺激後15分ではっきりとした蛍光の増加が観察された。
写真はいずれもDIC 像(グレー)、Hoechist 33342 による核染色(青)とOxiORANGE™ (オレンジ)または製品C(赤)との多重染色像。
使用顕微鏡: Leica DMI6000 CS, (HC PL Apo 40×0.85)

特徴2. 固定後にも観察可能

OxiORANGE™ はROS との反応により、蛍光物質に非可逆的に変化します。そのため固定後も蛍光が観察できます。

図4. 固定による蛍光の変化。
図4. 固定による蛍光の変化。

HeLa細胞を 1 μM の OxiORANGE™ と0.2 μg/mL Hoechist 33342 を含む培地で 30分間培養したのち、 HBSS で2回洗浄し、500 μM の H2O2 で刺激し、30分間に渡りROS 発生を観察した(左)。その後 3% PFA を含む PBS で 4℃ 20 分間固定してから、再度、同条件で撮影した(右)。
赤: OxiORANGE™, 青: Hoechist33342, グレー: DIC の重ね合わせ。
※ 使用顕微鏡: NIKON ECLIPSE Ti, (PlanFluor 40×0.75) ), Hamamatsu ORCA-R2

OxiORANGE™ の細胞内での局在は、固定により変化します。また、固定により蛍光が若干減弱することがあるため、ご使用前に条件検討を行ってください。

OxiORANGE™ の細胞内局在

OxiORANGE™ はミトコンドリアに局在しやすい性質がありますが、試薬濃度が高い場合や、他のミトコンドリア局在性試薬などと共存させること、その他の理由でミトコンドリア以外にも分布する場合があります。

OxiORANGE™ の細胞内局在

  • HeLa細胞をOxiORANGE™ (0.5 μM), MitoTrackerGREEN (0.25 μM), Hoechst33342と共染(0.2 μg/mL, 30 min incubation)
  • 過酸化水素で刺激 (100 μM 30 min)
  • 蛍光顕微鏡で観察

詳細なプロトコルはアプリケーションノートもご参照ください。

参考文献
Yuichiro Koide, Yasuteru Urano, Suguru Kenmoku, Hirotatsu Kojima, and Tetsuo Nagano (2007)
Design and Synthesis of Fluorescent Probes for Selective Detection of Highly Reactive Oxygen Species in Mitochondria of Living Cells
J. Am. Chem. Soc., 129(34) 10324-10325 doi: 10.1021/ja073220m
希望小売価格
型番 名称 容量 希望小売価格(円) プロトコル MSDS
GC3004-01 OxiORANGE™ 100 nmol ×5 ¥49,800 Download
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