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【活性酸素(ROS)検出用蛍光試薬】
HySOx

HySOx はHOCl (次亜塩素酸) を特異的に検出する蛍光試薬です。生細胞のイメージングに最適です。

特徴

  • 活性酸素種( OH, O2−・, HOCl, H2O2, 1O2,NO, HOONO 等)の中でも、次亜塩素酸に特異的に反応します。ヒドロキシラジカル、スーパーオキシド、過酸化水素、一重項酸素、一酸化窒素、パーオキシナイトライトでは蛍光強度は増加しません。
  • 褪色に強く、細胞内の次亜塩素酸産生のタイムラプスイメージングに適しています。

測定原理

HySOxは中性水溶液中でほとんど蛍光を発しませんが、次亜塩素酸と反応すると、強蛍光化合物に変化し (励起波長 553 nm、蛍光波長 574 nm) 、蛍光強度の増大が観測されます。  

HySOxと活性酸素種との反応性

図1. 活性酸素種に対するHySOxの選択性
図1. 活性酸素種に対するHySOxの選択性

HySOxは次亜塩素酸とのみ反応しS/N比は約170倍を示した。

  • HySOx (最終濃度5 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、以下の活性酸素種生成系を添加 (最終濃度)。
  • 励起波長553 nm、測定波長574 nm, slit width 2.5 nm, photon multiplier voltage 700V.
各活性酸素種生成条件

HOCl: NaOCl 5 μM
OH: 過塩素酸鉄 (II) 50 μM, H2O2 100 μM
ONOO: HOONO 5 μM
NO: NOC18 5 μM
O2-・: KO2 10 μM
H2O2: H2O2 100 μM
PB: リン酸バッファー (Negative control)

次亜塩素酸濃度に対するHySOxのスペクトル変化と定量性

  • HySOx (最終濃度5 μM, コソルベントとして0.1 % DMF) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、終濃度0〜15 μMになるようNaOClを加え、スペクトルを測定した。また、定量性試験はNaOClの終濃度0〜5 μMで行った。
  • 励起波長553 nm、測定波長574 nm, slit width 2.5 nm, photon multiplier voltage 700V.

図2. HySOxの次亜塩素酸の濃度依存的なスペクトル変化
図2. HySOxの次亜塩素酸の濃度依存的なスペクトル変化

HySOxは次亜塩素酸とモル等量1:2で飽和状態に達した。
(右上) 次亜塩素酸に対するHySOxの定量性
試験管内の反応において、HySOxは次亜塩素酸に対し濃度依存的な蛍光強度の増加を示した。

使用例
U937 cellのファゴサイトーシスにおける次亜塩素酸産生の観察
  1. PMAによりU937 cellを分化誘導した。
  2. HySOxをDMFに溶解させ、1 mM ストック溶液を作成した。
  3. ストック溶液をHBSSで希釈し、終濃度 5 μM の染色液を作成した。
  4. 培養容器から液体培地を除去し、HBSSで2回洗浄した。
  5. 培養容器に染色液を加え、37℃で30分間インキュベートした。
  6. 培養容器から染色液を除去し、HBSSで2回洗浄した。
  7. 新しいHBSSに置き換え、ZymosanAを加えて37℃で 30 分間タイムラプスイメージングを行った。
※ 使用顕微鏡: Leica DMI 6000 CS, 対物レンズ: 40倍

図3. ファゴサイトーシスに伴って次亜塩素酸を産生するU937 cell
図3. ファゴサイトーシスに伴って次亜塩素酸を産生するU937 cell

(左) U937 cellにZymosanAを添加した直後。
(中央) 約10分後、U937 cellにZymosanAが取り込まれ (白い矢印)、わずかに赤色蛍光が観察された。
(右) 約30分後、ファゴサイトーシスに伴い次亜塩素酸が産生され、HySOxの強いシグナルが検出された。
YouTube版

U937 cell
https://www.youtube.com/watch?v=PAyBEwesV-Y

RAW264.7 cell
https://www.youtube.com/watch?v=HFGghuqAwCQ
参考文献
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EBioMedicine. 2016 Aug; 10: 204-215.
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J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (23), pp 7313-7318 doi: 10.1021/ja068740g, publication date (Web): May 17, 2007
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型番 名称 容量 希望小売価格(円) プロトコル MSDS
GC3006-01 HySOx 20μg×5本 ¥49,800 Download
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