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【銅 (I) イオン検出用蛍光プローブ】
CopperGREEN™

銅はチトクロームc や superoxide dismutase (SOD)などの酵素活性に必要な生体中の微量元素です。CopperGREEN は、銅イオンの中でも、細胞中の還元環境下のCuI イオンを特異的に検出する蛍光試薬です。ライブセルイメージングにお使いいただけます。

CopperGREEN の特長

高い特異性
生体中の微量金属の中でも還元された銅イオン(CuI)のみを特異的に検出するユニークな蛍光プローブです。 CuII イオンやマンガン(MnII)、コバルト(CoII)、ニッケル(NiII)、鉄(FeII)、亜鉛(ZnII)の各イオンでは蛍光強度は増加しません。
S/N が高い
CuI と反応すると、100倍以上の蛍光強度増大が観察されます。

測定原理

CopperGREEN はほとんど無色、無蛍光の物質ですが、CuI イオンをキレートしたのちに分解・酸化され、緑色の蛍光物質(Exmax~480 nm Emmax=510 nm)に非可逆的に変化します。そのためマイルドな固定を行っても蛍光は保持されます。

測定原理

CopperGREENの反応性

CopperGREENの反応性

図1. さまざまな金属イオンおよび活性酸素種 (ROS) に対するCopperGREENの反応性
銅 (I) イオン存在下でのみ、CopperGREEN の顕著な蛍光増大が起こります。

  • 1 μM CopperGREEN を溶解したHEPESバッファー (0.05 M, pH 7.2, コソルベントとして0.1 % DMSOを含む)に、各金属イオン(20 μM)と2 mM グルタチオン、または下記の活性酸素種生成系を添加。37℃で120分反応後に蛍光強度を測定。ただし、CuII はグルタチオンを含まない。
  • 励起波長470 nm、測定波長510 nmの蛍光強度をTECAN Infinite M200マイクロプレートリーダーを用いて、励起バンド幅 9 nm、蛍光バンド幅 20 nm で計測。
活性酸素種生成条件

H2O2: 300 μM H2O2
OCl-: 300 μM NaOCl
OH: 20 μM過塩素酸鉄(II) + 200μM H2O2 + 200 μM EDTA
none: コントロールとして 0.05 M HEPES buffer のみ

CopperGREENの蛍光スペクトルおよび反応特性

CopperGREENの蛍光スペクトルおよび反応特性

図2. CopperGREEN のスペクトルおよび反応特性 (左)CopperGREEN のスペクトル変化。 CuI との反応により、510 nmを最大とする蛍光強度が増大する。(右)1 μM CopperGREEN と CuI との反応特性。ほぼモル比1:1で反応し、およそ90分で反応はほぼ飽和に達する。

  • (左)5 μM CopperGREENと CuI の反応前、反応後の蛍光スペクトルをHITACHI F-2700 分光蛍光光度計でスリット幅 2.5 nm, フォトマル電圧 700V にて測定。100 μM [CuI(CH3CN)4]PF6 , 50 mM HEPESバッファー (pH 7.2), 2 mM glutathione, コソルベントとして0.5 % DMSOを含む溶液中で37℃、2時間反応させた。
  • (右上) [CuI(CH3CN)4]PF6 濃度に応じた1 μM CopperGREENの蛍光強度変化。励起波長470 nm、測定波長510 nmの蛍光強度をTECAN Infinite M200 Pro マイクロプレートリーダーで、励起バンド幅 9 nm、蛍光バンド幅 20 nm で計測。50 mM HEPESバッファー (pH 7.2), 2 mM グルタチオンとコソルベントとして0.1 % DMSOを含む溶液で測定。
  • (右下)1 μM CopperGREENと 100 μM [CuI(CH3CN)4]PF6 との反応の時間経過。励起波長470 nm、測定波長510 nmの蛍光強度をHITACHI F-2700 分光蛍光光度計でスリット幅 5 nm, フォトマル電圧 700V にて計測。

細胞イメージング例

細胞イメージング例

CopperGREENで細胞に取り込ませた銅をイメージングできます。
写真は微分干渉像にCopperGREEN の蛍光シグナル(緑)を重ね合わせたもの。200 μMの CuCl2 を含む DMEM(+8% FBS, P.S.)中で一晩培養して銅を取り込ませたHeLa 細胞を 200 μM EDTA を含む PBS で洗浄して細胞外の銅イオンを取り除き、5 μM CopperGREEN を含む培地で3時間染色しました。
ライソソーム中での CopperGREEN の分解を防ぎ、より高いコントラストを得るために、染色30分前から染色中は培地に 10 mM NH4Clまたは 100 nM bafilomycin A1の添加をお勧めします。(上記写真では、10 mM NH4Cl を添加しています。)また、観察時は HBSS などフェノールレッドを含まないバッファーに置き換える必要があります。蛍光観察には GFP 用などの一般的な B 励起フィルターが使用できます。
参考文献
Masayasu Taki, Shohei Iyoshi, Akio Ojida, Itaru Hamachi, Yukio Yamamoto (2010)
J. Am. Chem. Soc., 132, 5938-5939; doi: 10.1021/ja100714p
希望小売価格
型番 名称 容量 希望小売価格(円) プロトコル MSDS
GC902 CopperGREEN™ 50nmol×5本 ¥49,800 Download
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