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βガラクトシターゼ活性の測定や細胞内可視化に。
GlycoGREEN™-βGal

特徴

  • 高感度かつ迅速にβ-ガラクトシダーゼを検出
  • 細胞毒性が低く、ライブセルイメージングに最適
  • 固定細胞でのイメージングや FACS 解析にも使用可能

GlycoGREEN™-βGal は、β-ガラクトシダーゼ検出用の蛍光プローブです。緑色蛍光を発するため、青色および赤色蛍光とのマルチカラーイメージングが可能です。

用途

  • lacZ レポーター遺伝子発現細胞の単一細胞スクリーニング
  • がん細胞マーカーとしてのβ-ガラクトシダーゼ活性の検出
  • 老化細胞のライブセルイメージング

測定原理

GlycoGREEN™-βGal はβ-ガラクトシダーゼの蛍光基質です。最初はほぼ無蛍光の試薬ですが、β-ガラクトシダーゼの酵素活性により強蛍光物質に変化します。活性化した色素は細胞膜付近に蓄積され、蛍光として観察可能です。また、β-ガラクトシダーゼとの反応性は迅速で、多くの場合15分程度のインキュベーションで結果が得られます。

測定原理

特徴 1 ライブセルイメージングに最適です

GlycoGREEN™-βGalは非特異的な蛍光が少なく、β-ガラクトシダーゼと反応して強い蛍光を発するため、ライブセルイメージングで高いコントラストの像が得られます。
また、通常使用される濃度での細胞毒性が低く、生体や細胞の機能を損なうことなく、さまざまなイメージングに応用できます。

図1. 生細胞にGlycoGREEN™-βGal を作用させたときの蛍光イメージおよび細胞障害性
図1. 生細胞にGlycoGREEN™-βGalを作用させたときの蛍光イメージおよび細胞障害性

(左)LacZ 遺伝子を発現した HEK293 細胞と、発現していない HEK293 細胞を1 μM の GlycoGREEN™-βGal および他社製品 S で 37℃ 15 分間反応させ、同一の照明・露光条件で蛍光顕微鏡観察した。どちらも高いコントラストの像が得られた。(右)卵巣がん由来のOVCAR5細胞に終濃度0, 0.1, 1, 10, 100 μM のGlycoGREEN™-βGalを添加し、37℃ 5% CO2条件下で24時間インキュベートした後、MTTアッセイにより細胞の代謝活性を測定した。通常使用濃度の10倍以上でも、細胞への障害性はほとんど検出されなかった。

特徴 2 高感度かつ迅速な検出が可能です

GlycoGREEN™-βGal はほぼ無蛍光ですが、β-ガラクトシダーゼにより迅速に分解され、反応前の100倍以上の蛍光を発します。そのため生細胞イメージングの場合でも、細胞に投与してから15分程度で充分な蛍光を高いコントラストで観察することができます。
※ 目的のβ-ガラクトシダーゼの発現量によっては、長時間のインキュベーションが必要になることがあります。

        図2. <I>β</I>-ガラクトシダーゼとGlycoGREEN™-<I>β</I>Galの反応曲線
図2. β-ガラクトシダーゼとGlycoGREEN™-βGalの反応曲線

GlycoGREEN™-βGal (最終濃度10 μM, コソルベントとして0.1 % DMSO) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、β-ガラクトシダーゼ (5 unit/mL) を加え37℃でインキュベートした。得られた溶液の経時的な蛍光強度の変化をマイクロプレートリーダー (TECAN infinite M200Pro) で20秒ごとに測定した。(励起波長 497 nm, 測定波長 519 nm, N=3)100倍以上の蛍光強度の増加が観察された。

特徴 3 固定細胞や FACS でも使用できます

GlycoGREEN™-βGalは高い細胞膜透過性があり、また反応後は細胞内にとどまります。染色後固定しても蛍光が保たれるほか、固定後に染色することも可能です。(固定により蛍光が弱くなることがありますので、固定条件を強くする場合は条件検討を行ってください。)

        図3. 固定条件でのGlycoGREEN™-<I>β</I>Galのイメージング
図3. 固定条件でのGlycoGREEN™-βGalのイメージング

(左)染色後固定では、HEK293 細胞を1 μM のGlycoGREEN™-βGal (上段) および他社製品 S(下段)と15分間反応させたのち、3%パラホルムアルデヒドを含むPBS で 15分間固定し、蛍光顕微鏡で観察した。(右)固定後染色では、HEK293 細胞を3%パラホルムアルデヒドを含むPBS で 15分間固定したのち、1 μM の各試薬と15分間反応させ、試薬を洗浄してから観察した。それぞれの固定条件ごとに、同一の照明・露光条件で蛍光顕微鏡観察した

また、フローサイトメーターによる FACS 解析にもお使いいただけます。

図4. FACS による測定例
図4. FACS による測定例

無染色のHEK293 (LacZ +), HEK293 (LacZ -) 細胞と、3 μM のAcidiFluor™ ORANGE (GC301) で18時間染色した HEK293 (LacZ -)細胞を、1 μM の GlycoGREEN™-βGal と 37℃ 1時間反応させたのち、PBS で洗い、フローサイトメーター (BD FACSVerse™) で解析した。LacZ 発現細胞と非発現細胞がシャープに分離された。

スペクトル

      図5. GlycoGREEN™-<I>β</I>Galの吸光および蛍光スペクトル
図5. GlycoGREEN™-βGalの吸光および蛍光スペクトル

  • GlycoGREEN™-βGal (最終濃度 10 μM, コソルベントとして0.1 % DMSO) を溶解したリン酸バッファー (0.1 M, pH 7.4) に、β-ガラクトシダーゼ (5 unit/mL) を加え、37℃で30分インキュベートした。得られた溶液の吸収および蛍光スペクトルを測定した。
  • 蛍光測定時の励起波長 497 nm, slit width 2.5 nm, photon multiplier voltage 700V.
参考文献
Asanuma D, Sakabe M, Kamiya M, Yamamoto K, Hiratake J, Ogawa M, Kosaka N, Choyke PL, Nagano T, Kobayashi H, Urano Y (2015)
Sensitive β-galactosidase-targeting fluorescence probe for visualizing small peritoneal metastatic tumours in vivo.
Nature Communications, 6:6463. doi: 10.1038/ncomms7463.
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