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【細胞内グルタチオン定量用蛍光プローブ】
QuicGSH3.0

分子内 FRET の原理により、2波長の蛍光強度比から細胞内グルタチオン濃度を定量できます。

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詳細はページ下部参照

特長

  • 細胞内のグルタチオン濃度測定に適した Kd 値 (3.0mM) を持つプローブです。
  • 溶液内、細胞内の還元型グルタチオン濃度変化に、可逆的かつ素早く反応します。
  • 光退色しにくく安定した測定が可能です。細胞毒性も低く、ライブセルイメージングに適しています。

測定原理と試薬の特性

特定の物質濃度に応じて蛍光強度が変化する蛍光プローブを用いると、試験管内ではその物質の濃度を定量することができますが、細胞内で物質濃度を測るのは難しくなります。なぜなら、細胞内に導入されたプローブ濃度がわからないためです。
QuicGSH3.0 は分子内 FRET の原理を利用して、プローブ濃度が不明でも細胞内の還元型グルタチオン(GSH)濃度を定量できる蛍光プローブです。(FRET = fluorescence resonance energy transfer)
QuicGSH3.0 はオレンジ色の蛍光色素Tと、深赤色の蛍光色素Sの2つのコンポーネントからなる分子です。GSH濃度が低いとき、緑色光で励起すると、励起された色素Tのエネルギーが共鳴効果により色素Sに移動し、深赤色の蛍光を発します。GSH濃度が高くなると、蛍光エネルギー移動が起こりにくくなり、緑色光で励起されたプローブはオレンジ色の蛍光を発します。

測定原理と試薬の特性

細胞内に導入された蛍光プローブの濃度にかかわらず、この2波長の蛍光強度の比はGSH濃度で決まります。そのため、2波長で蛍光強度を測定することで、細胞内のGSH濃度を決定できます。
Kd 値=3.0mM の QuicGSH3.0 は数ミリモル程度と考えられている細胞内GSH濃度の測定に最適です。GSH濃度に応じて蛍光強度の比はすみやかに変化するため、リアルタイムで細胞内GSH濃度の変化を追跡することも可能です。

吸収・蛍光スペクトル

QuicGSH3.0の吸収スペクトル(左)および蛍光スペクトル(右)
QuicGSH3.0の吸収スペクトル(左)および蛍光スペクトル(右)

還元型グルタチオン(GSH)と反応する前の最大蛍光波長は 625 nmですが、GSHと反応すると最大蛍光波長が582 nmに変化します。520-550 nm の緑色光で励起したとき、582 nm 付近の蛍光(蛍光波長1)と625 nm 付近の蛍光(蛍光波長2)の強度比は、GSH濃度に依存して変化します。

GSH濃度に対する2波長の蛍光強度比の変化
GSH濃度に対する2波長の蛍光強度比の変化

各濃度のGSHを加えた2 μM QuicGSH3.0 (0.2 M リン酸バッファー pH 7.4 に溶解。コソルベントとして5 % DMSOを含む) を 550 nm で励起し、582 nmと616 nmの蛍光強度を測定し、蛍光強度比をプロットしたもの。

迅速な反応性および可逆性

QuicGSH3.0は、還元型グルタチオン(GSH)と素早く反応し、最大蛍光波長が625 nmから582 nmに変化します。また、GSHが消失した場合には、最大蛍光波長が素早く582 nmから625 nmに戻ります。

QuicGSH3.0 の応答性

QuicGSH3.0 の応答性

QuicGSH3.0 (最終濃度2 μM, コソルベントとして5 % DMSOを含む) を溶解したリン酸バッファー (0.2 M, pH 7.4) に、GSHを加え27℃でインキュベートした。30分後にチオールスカベンジャーであるNEM (N-ethylmaleimide)を25 mM投与した。得られた溶液の経時的な蛍光強度の変化をマイクロプレートリーダー (TECAN infinite M200Pro) で60秒ごとに測定し、580 nmと620 nmの蛍光強度比を算出した。(励起波長 550 nm, 測定波長 580 nm, 620 nm, n=3 ± S.D.)

細胞イメージング例

細胞イメージング例

A549細胞を2 μM QuicGSH3.0(添加剤として0.01% Pluronic F-127を含む)と10分間反応させ、洗浄後に2波長で蛍光観察した像と、画像から算出した細胞内グルタチオン (GSH) 濃度。

詳細なプロトコル、解析方法や応用例につきましてはプロトコル、参考文献、およびご購入者限定説明書をご覧ください。

参考文献
Keitaro Umezawa, Masafumi Yoshida, Mako Kamiya, Tatsuya Yamasoba, Yasuteru Urano (2017)
Nat. Chem. 9: 279-286. DOI: 10.1038/nchem.2648
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2017年12月限定!価格はそのまま!A401-1 / A401-2 に 25 nmol 1本が付いてきます!!詳細は五稜化薬の営業またはお近くの代理店様までお問い合わせください。
【お客様および取扱店様へ】注文時にキャンペーンコード (2017GSH) を記載してください。キャンペーンコードのない注文書は通常の容量となりますので、ご注意ください。
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A401-1 QuicGSH3.0 25 nmol × 5本 6本 ¥69,800 Download
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  • グルタチオン濃度の算出には、まずお使いの装置で標準曲線を描く必要があります。そのとき多めの試薬が必要なため、特に顕微鏡イメージングの場合は最初に5本入りの A401-1 でご検討いただくことをおすすめします。
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