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【近赤外蛍光Ca2+プローブ】
CaSiR-1™/ CaSiR-1™ AM

  • 近赤外領域での発光
  • Ca2+認識による大きな蛍光強度変化
  • 生細胞イメージングが可能

CaSiR-1™ 及び CaSiR-1™ AM は664 nmの蛍光極大波長をもつ近赤外蛍光カルシウムプローブであり、Hoechst、Fluorescein、Rhodamineや、GFP、YFP、RFP等の可視光領域に蛍光波長を有する蛍光色素、蛍光タンパク質とのマルチカラーイメージングが可能です。この波長領域は、組織透過性に優れていること、バックグラウンド蛍光が小さいこと、細胞や組織への傷害性が小さいことも特長です。

CaSiR-1™ はカルシウムを認識すると蛍光強度が大きく変化します。具体的にはカルシウム濃度を0 μMから39 μMに変化させると、1000倍以上の蛍光強度上昇を示します。カルシウム濃度0 μM では蛍光がほとんど検出されません。

CaSiR-1™ はマイクロインジェクション、パッチクランプ、エレクトロポレーション等での細胞導入に適しています。CaSiR-1™ AM はCaSiR-1™のアセトキシメチルエステル体で、細胞膜を通過することができ、細胞内のエステラーゼにより加水分解されてCaSiR-1™になり、細胞内に滞留します。これら手法によりCaSiR-1™ が導入された生細胞では、細胞内カルシウム濃度変動を蛍光強度変化としてとらえることが可能です。また、神経細胞などに用いると、活動電位を細胞内カルシウム濃度変動として間接的にとらえることが可能です。

CaSiR-1™ / CaSiR-1™ AM の特長

Kd for Ca2+ 0.58 μM

励起波長 650 nm

蛍光波長 664 nm

量子収率 0.20

1. 近赤外領域での発光

マウス脳神経におけるCa2+イメージング。
図1. マウス脳神経におけるCa2+イメージング。

一部の脳神経にVenus(YFPの変異体)を発現したマウス脳スライスにCaSiR-1™ AMをロードし、Ca2+イメージングを行った。赤色はCaSiR-1™、緑色はVenusを示す。蛍光シグナル変化は、脳神経の発火に伴う一過性の細胞内Ca2+濃度上昇を可視化したものです。すなわち、この実験は、YFPが発現した神経細胞でのカルシウムの挙動と、発現していない神経細胞のカルシウムの挙動を比較するために行ったものです。このような特定の細胞を蛍光タンパク質などで標識したサンプルでのカルシウムイメージングをはじめ、様々なマルチカラーイメージングが可能です。
2. Ca2+認識による大きな蛍光強度変化

CaSiR-1™の蛍光スペクトル。
図2. CaSiR-1™ の蛍光スペクトル。

100 mM KCl、10 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) を含む 30mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) バッファー (pH 7.2) 中で、様々な濃度のCa2+(0, 0.017, 0.038, 0.065, 0.100, 0.150, 0.225, 0.351, 0.602, 1.35, 39μM)存在下におけるCaSiR-1™ の蛍光スペクトルを測定した。励起波長は620 nm。カルシウム濃度を0 μMから39 μMに変化させると、1,000倍以上の蛍光強度上昇を示した。
3. 生細胞イメージングが可能

HeLa細胞におけるCa2+イメージング。
図3. HeLa細胞におけるCa2+イメージング。

HeLa細胞に CaSiR-1™ AMをロードし、ATP及びイオノマイシン刺激を行った。プローブの一部はリソソームへ局在していることが確認されたが、Ca2+濃度変化の可視化が十分可能であった。
上記実験におけるHeLa 細胞染色の具体的なプロトコル
  1. CaSiR-1™ AMの2 mM DMSO溶液とPluronic F-127の20%DMSO溶液を1 : 1で混合し、これを1 mM stock solutionとした。
  2. CaSiR-1™ AMの最終濃度が3 μMとなるよう、HBSSに溶解し、染色液とした。 (Pluronic F-127 の最終濃度は0.03%)。
  3. HeLa細胞を培養しているガラスボトムディッシュからDMEMを除去し、HBSSで 3 回洗浄を行った。
  4. ガラスボトムディッシュに染色液を入れ、37℃、5% CO2 雰囲気下で 30 分間インキュベーションした。
  5. ガラスボトムディッシュから染色液を除去し、HBSSで3 回洗浄を行った後、HBSS中で薬剤による蛍光強度変化を観察した。
参考文献
F. Zhang, E. S. Tzanakakis (2017)
Scientific Reports 7:9357, DOI: 10.1038/s41598-017-09937-0
Mika Mizunuma, Hiroaki Norimoto, Kentaro Tao, Takahiro Egawa, Kenjiro Hanaoka, Tetsuya Sakaguchi, Hiroyuki Hioki, Takeshi Kaneko, Shun Yamaguchi, Tetsuo Nagano, Norio Matsuki and Yuji Ikegaya, Nat. Neurosci., 17, 503-505 (2014), "Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons"
Egawa T., Hirabayashi K., Koide Y., Kobayashi C., Takahashi N., Mineno T., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Ikegaya Y., Matsuki N., Nagano T., Hanaoka K. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 3874 -3877.
Egawa, T.; Hanaoka, K.; Koide, Y.; Ujita, S.; Takahashi, N.; Ikegaya, Y.; Matsuki, N.; Terai, T.; Ueno, T.; Komatsu, T.; Nagano, T. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 14157-14159.
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型番 製品名 容量 希望小売価格(円) プロトコル MSDS
GC401 CaSiR-1™ 1 mg ¥78,000 Download
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CaSiR-1™、CaSiR-1™ AM は東京大学大学院薬学系研究科薬品代謝化学教室(長野哲雄教授)のご指導の下、五稜化薬株式会社が製品化しました。

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