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【タンパク質・核酸標識用pHプローブ】
AcidiFluor™ ORANGE-NHS

  • 混ぜるだけ
  • S/N比が高い
  • タンパク質標識後も高いpH応答性

AcidiFluor™ ORANGE-NHSは、酸性環境下で蛍光が大幅に増大するプローブAcidiFluor™ ORANGEに、アミノ基への標識部位を加えたタンパク質・核酸標識用pHプローブです。N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)を介して、抗体やタンパク質等アミノ基を有する分子と混合するだけで安定な共有結合を形成します。
本製品は局所環境下でのpHモニタリングやエンドサイトーシス・エキソサイトーシスの検出などに最適です。

AcidiFluor™ ORANGE-NHSはタンパク質に標識した後も優れた選択性を持って酸性環境を検出し、酸性オルガネラ内の環境に相当するpH 5.0では、生理的pH 7.4と比較して蛍光強度は約20倍に増大します。また、励起光照射に伴う光褪色に対しても優れた耐性を示します。

544 nm での励起により、オレンジ色蛍光を発するため、CFP、Hoechst等の青色蛍光やGFPなどの緑色蛍光、近赤外蛍光と組み合わせたマルチカラーイメージングに使用可能です。
さらにイメージングだけではなく、プレートリーダーを用いて、化合物の取り込み等をハイスループットスクリーニングにより評価することが可能です。

図1. AcidiFluor™ ORANGE-NHSと抗体の反応
図1. AcidiFluor™ ORANGE-NHSと抗体の反応

AcidiFluor™ ORANGE-NHSの特長

λabs 544 nm

λfl 565 nm

pKa 5.3, 6.8

ε 80,000

S/N比が高い

図2. AcidiFluor™ ORANGE-NHSと他社pHプローブとのpH応答比較
図2. AcidiFluor™ ORANGE-NHSと他社pHプローブとのpH応答比較

pH 5 および7.4のリン酸緩衝液中(0.1 M)で、各pHプローブのNHS体およびBSA標識体の蛍光強度を比較した。pH 5.0におけるAcidiFluor™ ORANGE-NHSの蛍光強度はpH 7.4と比較して、約20倍に増大した。一方、pHrodo™ Red-NHS体 (Life Technology社) は約1.8倍、CypHer™ 5E-NHS体 (GE Healthcare) は約7.5倍であり、AcidiFluor™ ORANGE-NHSがより鋭敏に酸性pHを捉えた。同様にBSA標識体の測定結果から、標識後のpH応答性はAcidiFluor™ ORANGEのみで高く維持されることが示された。

AcidiFluor™ ORANGE-NHS : λex 532 nm / λem 568 nm
pHrodo™ Red-NHS (Life Technology社) : λex 560nm / /λem 582 nm
CypHer™ 5E-NHS (GE Healthcare社) : λex 644 nm / /λem 667 nm

実験例
AcidiFluor™ ORANGE-NHS - BSA標識体のHeLa細胞によるエンドサイトーシス観察
YouTube版
http://www.youtube.com/watch?v=wl-jOZsZIHo

pHプローブ-BSAのHeLa細胞endocytosis観察

図3. 細胞内の箇所を選択し、経時的な蛍光強度をグラフ化した。AcidiFluor™ ORANGE-BSAは、細胞に取り込まれると経時的に蛍光強度が上昇したが、pHrodo-BSA、CypHer5E-BSAは、蛍光強度変化は観察されなかった。

その他の応用例につきましてはアプリケーションノートをご覧ください。

参考文献
Hayashi A, Asanuma D, Kamiya M, Urano Y, Okabe S.
High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: Visualization of AMPA-type glutamate receptor endocytosis in living neurons
Neuropharmacology Volume 100, January 2016, 66-75
Hayashi A, Asanuma D, Kamiya M, Urano Y, Okabe S.
High affinity receptor labeling based on basic leucine zipper domain peptides conjugated with pH-sensitive fluorescent dye: visualization of AMPA type glutamate receptor endocytosis in living neurons.
Neuropharmacology. 2015 Jul 25. pii: S0028-3908(15)30033-2. doi: 10.1016/j.neuropharm.2015.07.026.
Asanuma D, Takaoka Y, Namiki S, Takikawa K, Kamiya M, Nagano T, Urano Y & Hirose K. Acidic-pH-Activatable Fluorescence Probes for Visualizing Exocytosis Dynamics. Angew Chem Int Ed 2014, doi:10.1002/anie.201402030.
Masayuki Isa, Daisuke Asanuma, Shigeyuki Namiki, Kazuo Kumagai, Hirotatsu Kojima, Takayoshi Okabe, Tetsuo Nagano, and Kenzo Hirose, ACS Chem Biol 2014 Oct 22;9(10):2237-41, "High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2."
Watanabe R, Soga N, Fujita D, Tabata KV, Yamauchi L, Kim SH, Asanuma D, Kamiya M, Urano Y, Suga H and Noji H.
Nature Communications 2014 Jul24; 5, Article number: 4519 doi:10.1038/ncomms5519 "Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity"
希望小売価格
型番 名称 標識部位 容量 希望小売価格(円) タンパク質
ラベル化
プロトコル
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AcidiFluor™
ORANGE-NHS
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303
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