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AcidiFluor™ ORANGE-NHS に関するQ&A

FAQ1. 標識率の求め方は?
下記公式により求めることが出来ます。
AcidiFluor™ ORANGE-NHSの濃度(分子)を、タンパク質の濃度(分母)で割ることで、「タンパク質1分子あたりに標識されたAcidiFluor™ ORANGE-NHSの分子数」を算出します。

標識率

A544, 280 : 標識体の 544 nm、280 nm における吸光度
CF : Correction Factor (0.12)
εAcidiFluor ORANGE-NHS : AcidiFluor™ ORANGE-NHS のモル吸光係数 (80,000)
εprotein : 標識タンパク質 のモル吸光係数  (IgG の場合、216,000)

FAQ2. 効率よく標識するには?
標識する抗体等、タンパク質は精製されたものを使用することをお勧めします。もし未精製のタンパク質に標識したい場合は、一度限外ろ過やゲルろ過などで夾雑物を除いた後に標識を行ってください。Trisなどアミノ基を含む物質が残存していると、そちらとも色素が反応するため、アミノ基を含まないリン酸緩衝液またはGood buffers (PIPES, HEPES 等)をご使用ください。
FAQ3. 固定細胞にも使えるの?
残念ながら、AcidiFluor™ ORANGE-NHS標識をしたタンパク質を取り込ませた後、細胞を固定すると蛍光を検出することは難しいです。細胞を固定することにより酸性小胞内の酸性環境が維持されなくなり、AcidiFluor™ ORANGE-NHSが光らなくなると想定されるからです。
FAQ4. 0.1 M Sodium bicarbonate buffer の作り方を教えてください。またこのバッファーを使う理由は?
炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) を 0.1 M になるように純水に溶解してください。およそ pH 8.0から8.4 程度になるはずですのでそのままお使いください。pH が外れている場合は、Na2CO3 や HCl などで微調整していただいても構いません。
NHS エステルと1級アミンの反応はpH 8.0から 8.6 付近で効率よく進行します。そのため、Tris buffer などのアミノ基を含むバッファー以外であれば、HEPES, リン酸バッファー、ホウ酸バッファーなども同様に使用可能です。
FAQ5. タンパク質の 280 nm での分子吸光係数はどのように調べたらよいですか?
タンパク質の 280 nm で吸光度は、Gill and von Hippel (1989) Analytical Biochemistry, 182: 319-326 や Anthis and Clore (2013) Protein Science 22:851-858などの方法で求めることができます。以下のような Web サイトでも計算サービスが提供されているようですが、ご利用にあたってはそれぞれのサイトの利用条件などの説明に従ってください。
 http://protcalc.sourceforge.net/
 http://web.expasy.org/protparam/
 http://nickanthis.com/tools/a205.html
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