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超解像ライブイメージング用蛍光試薬HMSiRを用いた
イメージング事例集

内容

HMSiR™標識抗体を用いた超解像イメージング

  • チオールや脱酸素剤の添加の必要なしに生理的条件下での超解像イメージングが可能
  • 強力なレーザー照射なしに自発的に明滅する蛍光プローブ

概要

HMSiR™-labeled secondary antibody は、HMSiR標識されたヤギ由来のIgG抗体です。固定細胞染色における2次抗体としてご使用いただけます。

HMSiR蛍光プローブは自発的に明滅を起こす蛍光プローブです。従前のdSTORM観察の際に必要とされてきたチオールや脱酸素剤の添加の必要がなく、かつ高出力レーザー照射が不要です。従って、弱い励起光照射での観測が可能となり、生理的条件下での超解像イメージングが可能です。

イメージング例

固定Hela細胞における微小管の超解像画像
図1.固定Hela細胞における微小管の超解像画像

固定したHeLa細胞に対して、マウス由来抗αチューブリン抗体 (1/300 diluted of 625901, BioLegend) を常温にて約2時間作用後、HMSiR™-labeled Goat anti-mouse IgG (H&L) (A202-01) 10 μg/mLを、常温にて暗所で約2時間作用させた。
ニコンN-STORMを用いて観察。647 nmレーザー100 W/cm2を使用。チオールや脱酸素剤の添加材等は入れていない。5000枚の画像から構築した超解像画像。

図2. 1分子局在化法による超解像イメージと通常の蛍光顕微鏡像との比較
図2. 1分子局在化法による超解像イメージと通常の蛍光顕微鏡像との比較

固定したHeLa細胞に対して、ラット由来抗チューブリン抗体 (1/300 diluted YL1/2, NB600-506, Novus Biologicals) を常温にて約2時間作用後、HMSiR™-labeled Goat anti-rat IgG (H&L) (A203-01) 10 μg/mLを、常温にて暗所で約2時間作用させた。647 nmレーザー100 W/cm2を使用してニコンN-STORMを使用して観察。通常の蛍光画像に相当する、5000枚の画像を積算した画像(左)と NIKON NIS-Elements を用いて各フレームごとに解析を行い超解像イメージを構築したもの(右)。

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ニコン超解像顕微鏡N-STORMに搭載された 3D-STORM 機能を用いた微小管の3次元イメージング

  • シリンドリカルレンズを用いた3次元イメージング

概要

HMSiR™ は生理的な溶液条件下で自発的に明滅を起こす蛍光プローブです。これまでのdSTORM観察の際に必要とされてきたチオールや脱酸素剤の添加の必要がなく、弱い励起光照射での観測が可能です。HMSiR 標識された試料を、ニコン超解像顕微鏡N-STORMに搭載されているシリンドリカルレンズを用いて撮影・解析することにより、対物レンズの焦点を上下させることなく、3次元蛍光画像を得ることができます。

HMSiR標識 Goat anti-mouse IgG (whole)により染色された
固定HeLa細胞内の微小管構造

HMSiR標識 Goat anti-mouse IgG (whole)により染色された固定HeLa細胞内の微小管構造

シリンドリカルレンズを通した蛍光像を撮影・解析することにより、光軸(Z軸)方向の位置を約50 nmの精度で抽出。平面の位置情報と組み合わせることで、3D 蛍光画像を再構築した。東京大学医科学研究所 顕微鏡コアラボラトリーにおいて撮影。

細胞染色プロトコル

Hela細胞の微小管染色例

細胞の固定
常法にて細胞の固定を行います。
  1. ガラスボトムディッシュ上に培養したHeLa細胞を3−4%パラホルムアルデヒドで、37℃で 10−20分間固定します。
  2. PBSで洗浄します。
  3. 冷メタノールで−20℃、5−10分間浸透処理します。
細胞の染色
  1. 任意でブロッキングを行います。5%BSA含有PBS中で30分間インキュベートします。
    その後、PBSで3回(各5分以上)洗浄します。
  2. 1次抗体で染色します。ここではマウス由来抗チューブリン抗体(Purified anti-Tubulin-α Antibody (625901), BioLegend)をPBSにて 10 μg/mL に希釈し、ガラスボトムディッシュ上の固定細胞に滴下し、常温にて約2時間作用させました。乾燥しないように wet chamber 中で加湿することを推奨します。
    その後、PBSで3回(各5分以上)洗浄します。
  3. HMSiR標識 Goat anti-mouse IgG (whole)をPBSにて10 μg/mL に希釈します。ガラスボトムディッシュ上の固定細胞に滴下し、常温、暗所にて約2時間作用させます。乾燥しないように wet chamber 中で加湿することを推奨します。
    その後、PBSで3回(各5分以上)洗浄します。必要に応じて、退色防止剤の添加や褪色防止能のある封入剤を使用してください。褪色を防ぎ、より多くの画像から高解像度の STORM 画像を得ることができます。
超解像観察
STORM顕微鏡(N-STORM) にて細胞観察を行います。エヴァネッセント場の励起光源は647 nmレーザー100 W/cm2を使用します。細胞はPBS中にてそのまま観察可能です。カメラ前のシリンドリカルレンズを挿入し、顕微鏡のマニュアルに従って画像を約10,000−30,000枚取得し、3D-STORM 解析を行います。
参考文献
S-n Uno, M. Kamiya, T. Yoshihara, K. Sugawara, K. Okabe, M. C. Tarhan, H. Fujita, T. Funatsu, Y. Okada, S. Tobita, Y. Urano (2014) Nature Chemistry 6:681-689.

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