アプリケーションノート 五稜化薬株式会社

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活性酸素検出用蛍光試薬OxiORANGE™ 応用例

HeLa細胞によるhROS産生の測定

細胞染色プロトコル
  1. OxiORANGE™ 1バイアル (100 nmol) をDMF 100 μLに溶解させ、1 mM ストック溶液を作成します。
  2. 色素をHBSSなどのバッファー、あるいは細胞培養メディウムで希釈し、終濃度1 μMの染色液を作成します。
    ※ 各細胞により適切な色素濃度およびインキュベーション時間は異なるため、最適化が必要です。弊社での検討では、HeLa細胞、マウスマクロファージ様細胞株 (RAW264.7細胞)、ラットマスト細胞株 (RBL-2H3細胞) およびヒト骨髄性白血病細胞株 (HL-60) にて、1 μM, 37℃ 20分の条件で良好な結果が確認できています。
  3. HeLa細胞より液体培地を除去し、HBSSなどのバッファーで1回洗浄を行います。
    ※ 培養容器は顕微鏡観察に適した「ガラスボトムディッシュ」等を推奨します。
  4. 培養容器に染色液を加え、 37℃で20分間インキュベーションします。
  5. 染色した細胞を洗浄バッファーで2回洗浄します。
  6. 洗浄後、適切な観察バッファーに置き換えます。
    ※ HeLa細胞は飢餓状態でROS産生が促進される報告があるため、フェノールレッドの含まれていない細胞培養メディウムの使用をおすすめします。
  7. 500 μM H2O2などを添加することで細胞のhROS産生を誘導し、タイムラプスイメージングを開始します。
    ※ 同検討では、添加後すぐに蛍光が観察されはじめ、約15分で十分な蛍光が確認できています。

OxiORANGE™によるHeLa細胞のhROS検出
OxiORANGE™によるHeLa細胞のhROS検出

※ 使用顕微鏡: NIKON Eclipse Ti, (PlanFluor 40×0.75) ), HAMAMATSU ORCA-R2

抗酸化剤 (NAC: N-acetyl-cysteine) を加えた細胞 (向かって右列) にくらべ、NACを加えていない細胞 (向かって左列) で蛍光強度の増強が見られた。 NAC は hROS を抑制することからも、OxiORANGE™ が細胞内 hROS を検出していることがわかる。

タイムラプス動画もYouTubeでご覧いただけます。

https://www.youtube.com/watch?v=eauZn0Ux8Zk

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