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【活性酸素(ROS)検出用蛍光試薬】
Hydroxyphenyl Fluorescein(HPF) / Aminophenyl Fluorescein(APF) 応用例

①光励起による自動酸化の検討

蛍光プローブ試薬添加
  1. 細胞にHPFまたはDCFH-DA(10 μM)を加えて、暗所で37 ℃、30 分間インキュベートした。
蛍光測定
  1. 共焦点蛍光顕微鏡で測定した(励起波長488 nm、蛍光検出515 nm以上)。
  2. 次に、細胞に488 nmのレーザーを10 秒間照射し、再度測定した。

Hydroxyphenyl Fluorescein(HPF) / Aminophenyl Fluorescein(APF)

②ブタ好中球のバイオイメージング

ブタ好中球の調製
  1. ブタ血液より好中球を分離した。
  2. 分離した好中球はKrebs-Ringer リン酸バッファー(114 mM NaCl、4.6 mM KCl、2.4 mM MgSO4、1.0 mMCaCl2、15 mM NaH2PO4/Na2HPO4、pH 7.4)中に懸濁させ、使用するまで氷冷した。次いでディッシュに移した。
プローブ試薬添加とPMAによる刺激
  1. HPF あるいはAPF(10μM)を加えて、室温で30 分間インキュベートした。
  2. 蛍光プローブ試薬を加えた好中球は4β-phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA)(2 ng/mL、0.1 % DMFをコソルベントとして含む)によって刺激した。
好中球のバイオイメージング
  1. PMA 刺激前と刺激10 分後に共焦点蛍光顕微鏡で測定した。
    (励起波長488 nm、測定505-550 nmフィルター使用)

Hydroxyphenyl Fluorescein(HPF) / Aminophenyl Fluorescein(APF)

③HPFとAPFの酵素系(HRP/H2O2系)への適用

反応のタイムコース
  1. 蛍光プローブ試薬(最終濃度 10 μM、コソルベントとして0.1 %DMFを添加)の0.2 μM HRP含有リン酸バッファー(0.1M、pH7.4)溶液にH2O2を1μM加えた。
  2. Hydroxyphenyl Fluorescein(HPF) / Aminophenyl Fluorescein(APF)HPF およびAPF の蛍光強度は励起波長490 nm、測定波長515 nmで測定した。
反応の直線性
  1. H2O2を最高濃度1μMまで加えた。
  2. HPF およびAPF の蛍光強度は励起波長490 nm、測定波長515 nmで測定した。

Hydroxyphenyl Fluorescein(HPF) / Aminophenyl Fluorescein(APF)


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