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GlycoYELLOW™-βGalを用いたイメージング・スクリーニング事例集

GlycoYELLOW™-βGalの特徴

  • ライブセルイメージングが可能
  • 高感度
  • 高い細胞内滞留性

内容

GlycoYELLOW™-βGalを用いた老化細胞イメージング
― 長崎大学原爆後障害医療研究所放射線災害医療学 鈴木啓司先生にご提供頂きました。 ―

GlycoYELLOW™によるSA-β-gal活性の生体染色v
GlycoYELLOW™-βGalによるSA-β-gal活性の生体染色

放射線照射後に持続的にG1期停止 (Fucciシステムにより確認) を起こした細胞(赤色蛍光の核の細胞)でSA-β-gal活性が亢進しています。
細胞は、放射線照射してから10日目であり、GlycoYELLOW™-βGal添加後24時間までを追跡しています。

正常ヒト甲状腺濾胞細胞の染色例

正常ヒト甲状腺濾胞細胞の染色例

正常ヒト甲状腺濾胞細胞に10Gyの放射線を照射し、10日間培養した後、GlycoYELLOW™-βGal (30分間染色) によるSA-β-gal活性を生体染色により検出しました。
この条件では、通常のX-galを用いた染色法でほぼ100%の細胞が染色されます。

正常ヒト甲状腺濾胞細胞の染色例

一方、わずかながら生存した細胞が増殖した領域(図左下)では染色は認められず、老化様細胞死を起こした細胞で特異的にSA-β-gal活性を検出していることが確認できます。

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GlycoYELLOW™-βGalを用いた
β-ガラクトシダーゼ活性のスクリーニング

概要

β-ガラクトシダーゼ (β-Gal) 活性は、汎用的なレポーター遺伝子や細胞の老化マーカー (SA-βGal) として広く使われています。従来のβ-Gal測定は、X-Galの呈色反応に基づいた定性的な細胞群の観察であり、単一細胞の解析は困難でした。GlycoYELLOW™-βGalはβ-Gal存在下で黄色蛍光を発する高感度な蛍光プローブです。生細胞・固定細胞のいずれでも使用可能なので、単一細胞における老化指標マーカーとして、細胞イメージングベースのスクリーニング系を始めとした薬理試験での活用が期待されます。この可能性を検証するため、LacZ遺伝子導入細胞におけるβ-Gal活性をOperetta™ (パーキンエルマー社) を用いて単一細胞レベルで解析し、比較検討しました。

※ 本アプリケーションは五稜化薬(株)とパーキンエルマージャパン(株)との共同開発です。

細胞染色プロトコル

β-ガラクトシダーゼ発現および非発現細胞 (HEK293細胞) の固定・染色プロトコル

細胞の固定・染色
  1. 96ウェルプレートをポリリジンでコーティングし、37℃で一晩インキュベートします。
  2. 96ウェルプレートをHBSSで2回洗浄します。
  3. トリプシン処理したHEK293細胞を、5×104 cell/ml, 200 μl/wellで96ウェルプレートに播種し、37℃, 5% CO2存在下で一晩培養します。
    ※ 推奨: 播種前の細胞を40 μmのセルストレイナーに通し、凝集している細胞を除去します。
  4. GlycoYELLOW™-βGalを終濃度5 μMになるようHBSSで希釈し、染色液を作成します。Hoechist33342を5000倍希釈にて添加します。
  5. HEK293細胞より培養液を除去し、HBSSで穏やかに1回洗浄します。
  6. 洗浄した細胞に染色液200 μl/wellを添加し、37℃, 5% CO2存在下で60分インキュベートします。
  7. 染色した細胞を、3% パラホルムアルデヒドで10〜30分間固定します。
    ※ 30分を超える時間の固定は蛍光強度が減少するためおすすめしておりません。
  8. 固定した細胞を、HBSSで 1 回洗浄を行い、新しいHBSS に置換します。
  9. 常法にて蛍光観察を行います。本アプリケーションではOperetta™にて観察・解析を行いました。

GlycoYELLOW™-βGal染色の画像解析

GlycoYELLOW(TM)-βGal染色の画像解析

各細胞の顕微鏡撮影画像

青色: Hoechist33342
黄色: GlycoYELLOW™-βGal
HEK LacZ (-) 細胞 (左) に比べ、HEK LacZ (+) 細胞 (右) は、明らかにGlycoYELLOW™-βGal由来の蛍光強度が増加していることが確認できました。

GlycoYELLOW(TM)-βGal染色の画像解析

Operetta™搭載の解析ソフトHarmonyにて画像解析を行った結果

(左) 画像中の個々の細胞の細胞質における蛍光強度
LacZ (+) 細胞はLacZ (-) 細胞に比べ、平均蛍光強度が7.5倍以上増加しました。
(右) 細胞数の自動カウント
解析対象の細胞数が十分であることが確認されました。

Operetta(TM)、画像解析に関するお問い合わせ

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