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CaTM-2™ AMを用いた細胞イメージング
― 赤色領域での発光 ―
― 高感度にCa2+を認識 ―
― 細胞質のCa2+変動を可視化 ―

概要

CaTM-2™ 及び CaTM-2™ AM は 609 nm に蛍光極大波長をもつ赤色蛍光カルシウムプローブであり、UV光から可視光領域に蛍光波長を有する蛍光色素 Hoechst、Fluoresceinや蛍光タンパク質 GFP、YFP等とのマルチカラーイメージングが可能です。長波長領域は、組織透過性に優れ、光細胞毒性が低いという利点があります。

CaTM-2™ / CaTM-2™ AM はカルシウムイオンとの解離定数(Kd)が0.20 μMであり、カルシウムイオン濃度に応じて感度良く赤い蛍光を発します。

CaTM-2™ / CaTM-2™ AM は細胞にロードすると細胞質に一様に分布する、細胞質でのカルシウム濃度の解析に最適な赤色蛍光のカルシウムプローブです。

CaTM-2™の特長

  • 赤色領域での発光
  • 高感度にCa2+を認識
  • 細胞質のCa2+変動を可視化
ラット脳スライス切片における神経細胞の自然発火の画像化

ラット脳スライス切片における神経細胞の自然発火の画像化

(a−c)CaTM-2 AMの蛍光像(a)、細胞体を同定するために用いたアクリジンオレンジの蛍光像(b)および、重ね合わせた蛍光像(c)。(d)CaTM-2の蛍光強度の時間変化。(a)内に示した 15 の位置において、神経細胞の発火に伴う細胞内カルシウムイオン濃度の変動を蛍光強度の変化としてとらえている。

CaTM-2™ AM で染色したHeLa細胞のカルシウムイメージング動画
YouTube版
https://www.youtube.com/watch?v=3Pr-PVJ7cJU

5μMのCaTM-2™ AMで染色を行ったHeLa細胞に、1 μMのヒスタミン(約13.5秒時点)と1μMのイオノマイシン(約98.5秒時点)で刺激を行った。各薬剤刺激によるカルシウム流入が蛍光強度の変化として表れている。

この動画は北海道大学ニコンイメージングセンターにて取得されました。

細胞染色プロトコル

ご用意頂くもの
  • Dimethylsulfoxide (DMSO、乾燥)
  • Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) などの色素導入用培地
  • 20 % Pluronic F-127 in DMSO
試薬の調製および細胞染色
  1. 50 μg の CaTM-2™ AM が入ったチューブに 41 μL のDMSO(乾燥)を加えて色素を溶解させ、これを 1 mM stocksolutionとする(導入効率の向上、局在の抑制のために、Pluronic F-127 を添加しておくことを推奨する)。
  2. CaTM-2™ AM の最終濃度が 1 - 10 μM となるよう HBSS などの適切な色素導入用の培地に溶解し、染色液とする(Pluronic F-127 の最終濃度は 0.01 - 0.05 %程度)。
  3. 細胞を培養している容器から培地を除去し、色素導入用の培地で洗浄を行う。 注: 培養容器は自家蛍光のない「ガラ スボトムディッシュ」等を推奨する。
  4. 培養容器に染色液を入れ、 37 ℃、5 % CO2 雰囲気下で 10-60 分間インキュベーションする。
  5. 容器から染色液を除去し、プローブを含まない培地で洗浄を行った後、 蛍光強度変化の観察を行う。
蛍光観察
励起波長は 597 nm が適している。用いるフィルタは、 Texas Red、Y-2E/C(Nikon 社)もしくはU-FYW、U-MWIY2(Olympus 社)等が使用できる。 蛍光波長はおよそ 609 nm をピークに検出される。
保存
色素は窒素封入、乾燥状態で冷凍出荷しております。入荷後は乾燥した冷暗所(-20 ℃以下)で保存してください。DMSO に溶解後は、1 回使い切りを推奨します。
参考文献
Egawa T., Hirabayashi K., Koide Y., Kobayashi C., Takahashi N., Mineno T., Terai T., Ueno T., Komatsu T., Ikegaya Y., Matsuki N., Nagano T., Hanaoka K. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 3874-3877.

CaTM-2™、CaTM-2™ AM は東京大学大学院薬学系研究科薬品代謝化学教室(長野哲雄教授)のご指導の下、五稜化薬株式会社が製品化しました。なお本製品は、JST先端計測分析技術・機器開発プログラムの一環として開発されました。

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