POLARIC™-NHS

POLARIC™標識化βアミロイドを用いた細胞取り込み
βアミロイドの取り込みを色の違いで可視化 ―


概要


βアミロイドの蓄積は、アルツハイマー病に密接な関わりがあります。そして脳に存在するマクロファージが、βアミロイドを排除するということが報告されています。POLARIC™-βアミロイドを使って、マクロファージ―ミクログリア細胞による貪食能の評価が可能となりました。POLARIC™-βアミロイドは488nmの励起光を照射するとオレンジ色を呈しますが、細胞膜結合由来のβアミロイドはグリーンに染色されるため、phagosomeの膜、内容物であるβアミロイドという微細な構造を観察することができます。マクロファージ貪食能の活性化/不活化物質のスクリーニング等にお使いいただけます。


POLARIC™ラベル化βアミロイド


POLARIC™標識化βアミロイドの特長

  • 細胞膜成分と、βアミロイドを異なる色で表示
  • 標識化による取り込み活性・細胞への影響は少ない
  • 比較試験としたTMR-βアミロイドは元の赤色のままであるが、POLARICは局在により2色に変化する

細胞イメージ

POLARIC-βアミロイドアンミックス画像

A. POLARIC-βアミロイド アンミックス画像

TMR™βアミロイド
B. 比較試験 TMR-βアミロイド

  1. オリゴマー化を行ったPOLARIC™標識化βアミロイドでガラスベースディッシュのコーティングを行い、ミクログリアを継代し37℃、5%CO2雰囲気下で1時間インキュベーションを行った。Nikon 共焦点レーザー顕微鏡A1を用いて撮影。488nmで励起し、490nm~650nmのスペクトル画像を取得、アンミックス加工を行った(緑:取り込み後細胞膜結合由来のβアミロイド、オレンジ:取り込み前 / 小胞内βアミロイド)。
  2. 比較試験。オリゴマー化を行ったTMR標識化βアミロイドを用いてA.と同様に観察を行った(赤:βアミロイド)
  • 各反応機構の詳細についてはさらに検討中です。

TMRでは元の赤色のままであるが、POLARICでは、細胞内の局在により色の変化が起こった。


ミクログリアによるPOLARIC™標識化βアミロイド貪食試験プロトコル

試薬の調製及び細胞貪食観察方法
  • POLARIC™標識化βアミロイドを、オリゴマー/ファイバー化させる
    1. POLARIC™標識化βアミロイドを1 mg秤量し、1 mMとなるようにhexafluoroisopropanol(HFIP)に溶解させる。
    2. 遠心濃縮装置でHFIPを除き、乾燥させる。
    3. 無水DMSOに再溶解させ、5 mMとする。
    4. Oligomer化するには、Ham’s F-12 medium(-phenol red)に終濃度100μMとなるように溶解、4℃で24時間インキュベートさせる。
    5. Fibril化するには、10mM HClに終濃度100μMとなるように溶解させ、37℃で24時間インキュベートする。
  • 1時間~24時間程度培養し、蛍光観察を行う。

蛍光観察方法
  1. 励起波長は 488 nm が適当。用いるフィルタは、GFP-LP(Nikon 社)もしくはU-MWB2(Olympus 社)等のロングパスフィルタが適当。アルゴンレーザーを用いる場合は、488 nm または 514 nmの波長の選択が望ましい。
  2. 蛍光波長はおよそ 520~650nm の範囲で検出される。

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